对正丁醇特异性响应的BmoR蛋白突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种对正丁醇特异性响应的BmoR蛋白突变体，及其在正丁醇检测或生物传感器中的应用。所述BmoR蛋白突变体是在序列表SEQ ID NO.1所示的野生型BmoR蛋白的基础上发生包含I183T和/或D273N的突变获得的。I183T、D273N和I183T/D273N突变体仅对正丁醇敏感，对异丁醇无响应，解决了野生型BmoR蛋白无法区分正丁醇和异丁醇高产菌株的问题；同时I183T/D273N对正丁醇的检测范围达到0

【技术实现步骤摘要】
对正丁醇特异性响应的BmoR蛋白突变体及其应用

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[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种对正丁醇特异性响应的BmoR 蛋白突变体，及其在正丁醇检测或生物传感器中的应用。

技术介绍
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[0002]微生物合成的正丁醇是重要的运输燃料，通过代谢工程合成正丁醇在许多微生物宿主中实现，而改造宿主菌株并筛选出高产宿主是实现醇工业化生产的基础和关键。生物传感器能够特异性响应目标化合物从而输出便于检测的蛋白信号，因而已经被广泛应用于高通量筛选。
[0003]生物传感器由分子识别元件和信号转换器组成。当分子识别元件与被测物体结合时，所产生的信号可以通过转换器转换为光信号或电信号，可对被测物进行检测和分析。作为一种合成生物学新兴工具，可以通过设计构建生物传感器来动态的响应信号分子浓度的变化。与此同时，生物传感器的设计是为了促进微生物细胞工厂的优化和生产一系列广泛应用于工业的天然产品，如衣康酸、脂肪酸、异丁醇、正丁醇和生物碱。生物传感器主要包括RNA核酸开关、转录因子调控的生物传感器、G蛋白偶联受体以及荧光蛋白生物传感器。而荧光蛋白生物传感器的低动态范围、RNA核酸开关难以在体外进行、G蛋白偶联受体仅能在胞外进行等弊端阻碍了生物传感器在生物界的发展。
[0004]基于转录因子(TF)的生物传感器应用最为广泛。最常用的转录因子是细菌转录因子，包括配体结合结构域(LBD)或代谢结合结构域(MBD)和DNA结合结构域(DBD)。BmoR是假单胞菌正链烷烃代谢途径的转录因子，是bEBP的成员，用于调节烷烃单加氧酶的σ
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依赖型启动子P
bmo
，信号分子是C2
‑
C5的直链或支链醇。但野生型转录因子BmoR存在响应特异性差，对底物正丁醇和异丁醇均会产生响应，无法对其中一种醇进行特异响应，从而满足工业需求；以及检测范围窄(0
‑
40mM)等问题，无法广泛应用于生物传感器中。因此实现对醇的特异响应成并提高检测范围成为亟待解决的问题。
[0005]本专利技术通过蛋白质改造得到的BmoR蛋白突变体，不仅可以实现对正丁醇的特异响应，还提高了其底物检测上限及响应强度，为高效检测正丁醇和快速筛选高产菌株提供了一种解决方案。

技术实现思路
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[0006]本专利技术的目的在于提供一种可以区分正丁醇和异丁醇的BmoR蛋白及生物传感器和应用。利用易错PCR技术构建随机突变文库，通过外源添加正丁醇和异丁醇，对突变库进行筛选分析，最终得到了仅对正丁醇响应的BmoR突变体蛋白。
[0007]进一步地，所述仅对正丁醇响应的BmoR突变体蛋白，是在序列表SEQ ID NO.1所示的野生型BmoR蛋白的基础上发生I183T和/或D273N突变获得的，以下简称I183T突变体、D273N突变体和I183T/D273N突变体(同时发生I183T 和D273N突变)，所述突变体蛋白具体为：
[0008](1)序列表SEQ ID NO.3、5或7所示的氨基酸序列；或
[0009](2)SEQ ID NO.3、5或7同源性75％以上的氨基酸序列；或
[0010](3)在SEQ ID NO.3、5或7的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有SEQ ID NO.3、5或7相同功能的氨基酸序列。
[0011]进一步地，本专利技术还提供I183T突变体、D273N突变体和I183T/D273N突变体的编码基因；
[0012]更进一步地，所述编码基因如序列表SEQ ID NO.4、6或8所示。
[0013]本专利技术的另一目的是提供I183T突变体、D273N突变体或I183T/D273N突变体的应用，特别是在检测含正丁醇的样品或筛选正丁醇生产菌株中的应用，更特别地，是在构建检测正丁醇的生物传感器中的应用；
[0014]进一步地，所述生物传感器是基于I183T突变体、D273N突变体或 I183T/D273N突变体的生物传感器，所述传感器是包含I183T突变体、D273N突变体或I183T/D273N突变体编码基因及其启动子、启动子P
bmo
及报告基因的表达元件；启动子启动bmoR基因表达，BmoR蛋白与醇分子结合形成六聚体，进而启动下游启动子P
bmo
，从而表达报告基因，产生荧光等信号；所述生物传感器能够实现对0
‑
100mM浓度下的正丁醇的特异性响应和筛选，进一步应用于工业生产中，实现对含正丁醇的样品以及正丁醇生产菌株的特异性筛选；
[0015]进一步地，所述突变体编码基因的启动子包括但不限于P
bmoR
、P
tac
、P
T7
、 P
LlacO1
等；
[0016]进一步地，所述报告基因包括但不限于gfp、rfp、cfp、sfgfp、egfp、yfp、ecfp 等基因；
[0017]优选地，所述生物传感器为包含I183T突变体、D273N突变体或I183T/D273N 突变体编码基因及其启动子P
bmoR
、启动子P
bmo
及gfp报告基因的重组质粒；进一步地，所述重组质粒可选用的表达载体包括但不限于本领域通用的表达载体，如pET、pUC19、pMAL等；
[0018]更优选地，所述生物传感器是将质粒pYH1上的野生型BmoR蛋白编码基因替换为I183T突变体、D273N突变体或I183T/D273N突变体编码基因所得，也即，将由P
bmoR
启动的I183T突变体、D273N突变体或I183T/D273N突变体编码基因连接至colE1复制起始位点、amp
r
和P
bmo
驱动的gfp基因所得；
[0019]进一步地，所述正丁醇生产菌株包括但不限于大肠杆菌，酿酒酵母，枯草芽孢杆菌等；
[0020]进一步地，所述启动子P
bmoR
的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；
[0021]进一步地，所述启动子P
bmo
的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；
[0022]进一步地，所述gfp报告基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示。
[0023]本专利技术还提供上述生物传感器在正丁醇检测中的应用，特别是在含有正丁醇的环境、食品、医学、生物类样品，或正丁醇生产菌株筛选中的应用，通过将上述质粒导入生产菌株，如大肠杆菌，酿酒酵母，枯草芽孢杆菌等，或将上述质粒导入单独的宿主中(如大肠杆菌XL10
‑
Gold等)后加入检测体系中，用以检测正丁醇的产生。
[0024]有益效果：
[0025]1、基于BmoR的生物传感器可用于筛选高产正丁醇或异丁醇菌株，但野生型BmoR对正丁醇和异丁醇均具有响应，无法区分，特异性差，本专利技术提供的 I183T、D273N和I183T/D273N突本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种BmoR突变体蛋白，其特征在于，所述突变体是在序列表SEQ ID NO.1所示的野生型BmoR蛋白的基础上，发生包含I183T和/或D273N的突变获得的。2.如权利要求1所述的BmoR突变体蛋白，其特征在于，所述突变体蛋白具体为：(1)序列表SEQ ID NO.3、5或7所示的氨基酸序列；或(2)SEQ ID NO.3、5或7同源性75％以上的氨基酸序列；或(3)在SEQ ID NO.3、5或7的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有SEQ ID NO.3、5或7相同功能的氨基酸序列。3.权利要求1所述BmoR突变体在检测含有正丁醇的样品，或在筛选正丁醇生产菌株中的应用。4.权利要求1所述BmoR突变体在构建检测正丁醇的生物传感器中的应用。5.权利要求1所述BmoR突变体的编码基因。6.如权利要求5所述的编码基因，其特征在于，如序列表SEQ ID NO.4、6或8所示。7.包含权利要求5所述编码基因的重组质粒或重组菌株。8.一种生物传感器，其特征在于，所述的传感器是包含权利要求5所述突变体编码基因、由BmoR突变体激活的启动子P
bmo...

【专利技术属性】
技术研发人员：霍毅欣，陈振娅，毋彤，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：