基于一步式夹心法检测待测物的纳米等离子共振芯片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基于一步式夹心法检测待测物的纳米等离子共振芯片其制备方法和应用，属于纳米等离子共振生物芯片检测技术领域；本芯片包括基片和修饰在基片上的包被抗体，基片上还集成有微纳颗粒，微纳颗粒上结合了标记抗体；基片包括基底和从下至上依次镀在基底表面且厚度为2

【技术实现步骤摘要】
基于一步式夹心法检测待测物的纳米等离子共振芯片及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于纳米等离子共振生物芯片检测
，特别是基于一步式夹心法检测待测物的纳米等离子共振芯片及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]表面等离子共振(SPR)是一种利用衰减全反射棱镜耦合方法，实现激光激发表面等离子波，通过检测全反射角度的变化，引起消光光谱的移动，进而获取生化反应的信息的检测方法。表面等离子共振芯片在抗体、抗原、肿瘤标志物等定性定量检测方面应用广泛。例如，中国专利申请CN106442427A提供了一种检测磺胺的表面等离子体共振免疫方法，该方法通过将固定等离子体共振芯片用EDC和NHS混合液活化，再通入通入磺胺
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OVA溶液，使芯片完成磺胺
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OVA包被修饰，对四种磺胺类药物(磺胺喹恶啉、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑和磺胺甲氧嗪)进行定性定量检测。
[0003]纳米表面等离子共振技术(NanoSPR)是一项完全不同于等离子共振芯片技术(SPR)的全新定性定量检测技术，它是在芯片上制作出直径不超过500nm的纳米孔阵列，通过入射光与金属纳米孔结构的共振耦合，利用表面等离子体共振的波长对于纳米结构周围介电环境的敏感性，实现对生化反应的检测。当吸附分子的折射率与周围环境的折射率存在差异时，吸附于基底表面的生物分子与目标分子的反应会改变基底表面的折射率，从而引起共振峰的变化，实现目标待测物质的检测。因此，纳米表面等离子体传感器的共振分析过程无需使用传统SPR技术那样的复杂光学系统。r/>[0004]夹心法是一种常见的定性定量检测方法，先将抗体吸附在载体上，然后加待测物，如果待测物中有相应抗原，则与抗体结合；洗涤后加入酶标记的另一种抗体与抗原结合；洗涤后加酶底物经酶催化产生有色产物，即可用肉眼观察或分光光度计测定。然而，利用胶体金和夹心法的思路制备的胶体金试纸条，一般需要使用含有各种复杂试剂的试剂盒，且操作繁琐，耗时长，存在检测效率低的问题。但是，利用NanoSPR技术只需简单的一步法操作就可以在短时间内实现高通量(96孔微孔板)检测，节省时间成本，人力成本。

技术实现思路

[0005]针对以上现有技术的不足，本专利技术将胶体金夹心法与纳米等离子共振技术(NanoSPR)联用起来，提供了基于一步式夹心法检测待测物的纳米等离子共振芯片及其制备方法和应用，具体通过以下技术实现。
[0006]基于一步式夹心法检测待测物的纳米等离子共振芯片，包括基片和修饰在所述基片上的包被抗体，所述基片上还集成有微纳颗粒，所述微纳颗粒上结合了标记抗体；所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为2
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30nm钛膜层、10
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90nm银膜层和2
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60nm金膜层，所述包被抗体用于与待测物特异结合；所述基底表面压印矩阵排列的纳米孔；所述包被抗体和标记抗体分别与待测物特异性结合。
[0007]上述NanoSPR生物芯片的基片可以采用目前公知的制备方法制成，例如，可以首先激光干涉光刻在硅晶圆纳米柱模具上制作纳米孔阵列，然后将紫外光固化聚合物溶液涂覆在清洁的硅晶圆纳米柱模具上，采用匀胶仪使表面的胶溶液均匀铺展，再将聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄板缓慢贴合于覆盖有紫外光固化聚合物的纳米柱模具上，使之于模具完全贴合，置于紫外线下进行固化处理；接着将PET薄板连同带有纳米杯阵列的紫外光固化聚合物从模具上剥离，即得到基底；最后在纳米杯阵列表面依次蒸镀钛膜、银膜、金膜，即得到NanoSPR生物芯片的基片。在基片的表面先后负载了包被抗体和标记抗体。包被抗体和标记抗体能够分别与待测物的不同表位特异性结合，形成夹心复合物。只要各类待测物的标准品及其包被抗体、标记抗体可以市场采购获得，并且满足夹心法的技术原理，就可以使用本专利技术提供的上述技术手段进行定性定量检测。
[0008]如上所述，本专利技术提供的NanoSPR生物芯片的基片，即一种结构为基底+钛膜层(2
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30nm)+银膜层(10
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90nm)+金膜层(2
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60nm)，使用这种结构的基片制备SPR芯片，都能获得比较准确的定性定量检测结果，检测限较低。
[0009]优选地，所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为10
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25nm钛膜层、40
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60nm银膜层和15
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50nm金膜层。
[0010]更优选地，所述微纳颗粒为结合了标记抗体的金纳米颗粒(例如胶体Au
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NPs等)、金纳米棒、金纳米星、中空纳米金、乳胶微球或磁性微纳颗粒。
[0011]本专利技术还提供了上述基于一步式夹心法检测待测物的纳米等离子共振芯片的制备方法，包括以下步骤：
[0012]S1、清洗基片，滴加包被抗体的工作液，加入到所述基片上孵育，再用PBST缓冲液清洗若干次已包被了包被抗体的基片，再先后加入封闭液和保护液处理，干燥后后待用；
[0013]S2、利用胶体金技术将标记抗体标记至金颗粒上，离心后弃去废液，管中金颗粒待用；
[0014]S3、复溶步骤S2所得金颗粒，取1
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5μl点样至步骤S1所得基片上，真空干燥后制成纳米等离子共振芯片成品。
[0015]优选地，上述制备方法中，步骤S3具体为以下三种方法的任意一种：
[0016]S31、使用Au抽干液复溶步骤S2所得金颗粒，取1
‑
5μl点样至步骤S1所得基片上；真空抽干3
‑
10min后制成纳米等离子共振芯片成品；
[0017]S32、使用Au冻干液复溶步骤S2所得金颗粒，取1
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5μl点样至步骤S1所得基片上；再在
‑
80℃条件下冻存2
‑
3h，最后真空抽干3
‑
10min后制成纳米等离子共振芯片成品；
[0018]S33、使用Au烘干液复溶步骤S2所得金颗粒，取1
‑
5μl点样至步骤S1所得基片上；再在37℃条件下烘干制成纳米等离子共振芯片成品。
[0019]更优选地，所述Au抽干液为目前常用的Hanks buffer、PBS buffer或Tris buffer溶液，并且还含有质量分数为0.1
‑
10％的蔗糖、葡萄糖或海藻糖，以及0.02
‑
2.5％的PEG、0.03
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0.1％的P300，pH值6
‑
9；
[0020]Au冻干液为目前常用的Hanks buffer、PBS buffer或Tris buffer溶液，并且还含有质量分数为0.5
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10％的蔗糖或葡萄糖，以及0.05
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2.5％的PEG、0.05
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0.2％的P300，0.05
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3％的甘露醇，pH值5
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于一步式夹心法检测待测物的纳米等离子共振芯片，其特征在于，包括基片和修饰在所述基片上的包被抗体，所述基片上还集成有微纳颗粒，所述微纳颗粒上结合了标记抗体；所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为2
‑
30nm钛膜层、10
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90nm银膜层和2
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60nm金膜层，所述包被抗体用于与待测物特异结合；所述基底表面压印矩阵排列的纳米孔；所述包被抗体和标记抗体分别与待测物特异性结合。2.根据权利要求1所述的纳米等离子共振芯片，其特征在于，所述基片包括基底和从下至上依次镀在所述基底表面且厚度为10
‑
25nm钛膜层、40
‑
60nm银膜层和15
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50nm金膜层。3.根据权利要求1或2所述的纳米等离子共振芯片，其特征在于，所述微纳颗粒为结合了标记抗体的金纳米颗粒、金纳米棒、金纳米星、中空纳米金、乳胶微球或磁性微纳颗粒。4.权利要求1或2所述的基于一步式夹心法检测待测物的纳米等离子共振芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、清洗基片，滴加包被抗体的工作液，加入到所述基片上孵育，再用PBST缓冲液清洗若干次已包被了包被抗体的基片，再先后加入封闭液和保护液处理，干燥后后待用；S2、利用胶体金技术将标记抗体标记至金颗粒上，离心后弃去废液，管中金颗粒待用；S3、复溶步骤S2所得金颗粒，取1
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5μl点样至步骤S1所得基片上，真空干燥后制成纳米等离子共振芯片成品。5.根据权利要求4所述的基于一步式夹心法检测待测物的纳米等离子共振芯片的制备方法，其特征在于，步骤S3具体为以下三种方法的任意一种：S31、使用Au抽干液复溶步骤S2所得金颗粒，取1
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5μl点样至步骤S1所得基片上；真空抽干3
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10min后制成纳米等离子共振芯片成品；S32、使用Au冻干液复溶步骤S2所得金颗粒，取1
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5μl点样至步骤S1所得基片上；再在
‑
80℃条件下冻存2
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3h，最后真空抽干3
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10min后制成纳米等离子共振芯片成品；S33、使用Au烘干液复溶步骤S2所得金颗粒，取1
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5μl点样至步骤S1所得基片上；再在37℃条件下烘干制成纳米等离子共振芯片成品。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽萍，李睿，刘钢，陈友倩，曾少奇，
申请(专利权)人：量准上海医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：