一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针及其制备方法与应用，其分子式为C

【技术实现步骤摘要】
一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及化学分析检测领域，尤其涉及一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]中性粒弹性蛋白酶是由中心粒分泌的一种丝氨酸蛋白酶，它能够轻易降解细胞外基质蛋白，包括弹性蛋白，I
‑
IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖和纤维连接蛋白。大量研究表明，弹性蛋白酶的过渡表达会导致许多疾病，如慢性阻塞性肺病、急性肺损伤、类风湿性关节炎、囊性纤维化和急性呼吸窘迫综合征等。此外，弹性蛋白酶在促进肿瘤生长、促进肿瘤侵袭转移方面发挥着重要作用，并可引起胰岛素抵抗。因此，建立一种灵敏、选择性的方法来监测细胞和生物体中的弹性蛋白酶具有重要意义。
[0003]迄今为止，检测弹性蛋白酶的方法有色谱法、质谱法、电化学法以及比色法，然而，它们大多数操作起来复杂，检测时间长，并且不能用于生物系统的体内监测。因此，迫切需要开发一种有效的检测方法来检测体内弹性蛋白酶。荧光分析法具有灵敏高、选择性好、操作简单、原位无损检测、时空分辨率好、实时监测等优点等，受到了国内外研究人员的广泛关注。
[0004]目前用于检测弹性蛋白酶活性的小分子荧光探针只有四种，但是这些探针的斯托克斯位移相对较小，使得自发荧光干扰大、组织穿透，从而限制了复杂生物系统的应用。因此，开发一种具有大的斯托克斯位移的新探针显得尤为重要。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针及其制备方法与应用，该荧光探针斯托克斯位移大，可降低背景荧光干扰、提高灵敏度。
[0006]为达到上述技术目的，本申请采用以下技术方案：
[0007]第一方面，本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针，其分子式为C
18
H
15
F5N2O3，其结构式如式(I)所示，
[0008][0009]第二方面，本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0010]S1.以8
‑
羟基久洛尼定
‑9‑
甲醛及硝基乙酸乙酯为原料，于溶剂中加热回流反应，经分离纯化，得到第一中间体；
[0011]S2.在酸性条件下，以氯化亚锡二水合物及第一中间体为原料，搅拌反应后，经分离纯化，得到第二中间体；
[0012]S3.在吡啶存在条件下，以第二中间体及五氟丙酸酐为原料，于溶剂中，搅拌反应，经分离纯化后，即得荧光探针；
[0013]其合成路线如下：
[0014][0015]优选的，8
‑
羟基久洛尼定
‑9‑
甲醛与硝基乙酸乙酯的摩尔比为1:1
‑
2。
[0016]优选的，氯化亚锡二水合物与第一中间体的摩尔比为3
‑
4:1。
[0017]优选的，第二中间体与五氟丙酸酐的摩尔比为1：1
‑
4。
[0018]优选的，步骤S2中，分离纯化的步骤为，在冰水浴的条件下冷却反应产物并用碱调pH值至9，再用乙酸乙酯萃取、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，而后利用硅胶柱层析进行分离。
[0019]第三方面，本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针的应用，荧光探针用于弹性蛋白酶的体外或体内检测。
[0020]优选的，荧光探针用于水环境中弹性蛋白酶的定性定量检测。
[0021]优选的，的荧光探针用于活体细胞及活体斑马鱼内源性弹性蛋白酶的检测和成像，细胞用于非治疗目的。
[0022]优选的，荧光探针用于检测浓度为0
‑
10U/mL的弹性蛋白酶的定性定量检测。
[0023]本申请的有益效果如下：
[0024]本专利技术制备的荧光探针，斯托克斯位移大(165nm)，灵敏度高(0.16 U/mL)，荧光强度倍数高(21倍),亲和力强(K
m
＝5.02
±
0.38μM)，选择性好；
[0025]本专利技术制备的荧光探针，细胞毒性低，生物相容性好，能够对细胞和斑马鱼中内源性弹性蛋白酶进行监测和成像。
附图说明
[0026]图1为本专利技术实施例1所得荧光探针的1H NMR谱图；
[0027]图2为本专利技术实施例1所得荧光探针的
13
C NMR谱图；
[0028]图3为本专利技术实施例1所得荧光探针的HRMS谱图；
[0029]图4为本专利技术实施例1所得荧光基团的1H NMR谱图；
[0030]图5为本专利技术实施例1所得荧光基团的HRMS谱图；
[0031]图6为本专利技术实施例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶响应的紫外吸收光谱图；
[0032]图7为本专利技术实施例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶响应的荧光光谱图；
[0033]图8为本专利技术实施例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶的荧光强度与响应时间的关系；
[0034]图9为本专利技术实施例1所得荧光探针对不同浓度的弹性蛋白酶滴定测试图；图10为本专利技术实施例1所得荧光探针在低浓度范围内检测弹性蛋白酶的检测限测试图；
[0035]图11为本专利技术为不同浓度的荧光探针和荧光团在535nm处的荧光光谱图；
[0036][0037]图12为本专利技术实施例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶的酶动力学测试图；
[0038]图13为本专利技术实施例1所得荧光探针对弹性蛋白酶及其他分析物响应的选择性实验图；
[0039]图14为本专利技术实施例1所得荧光探针检测弹性蛋白酶的高效液相色谱；
[0040]图15为本专利技术实施例1所得荧光探针检测活细胞中弹性蛋白酶的荧光成像图；
[0041]图16为本专利技术实施例1所得荧光探针检测斑马鱼中弹性蛋白酶的荧光成像图；
[0042]图17为荧光探针与弹性蛋白酶的作用机理。
具体实施方式
[0043]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0044]本申请提供本申请提供一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针，其分子式为C
18
H
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F5N2O3，其结构式如式(I)所示，
[0045][0046]该荧光探针具有灵敏度高、选择性好，亲和性强以及斯托克斯位移大等优点。该探针与弹性蛋白酶结合后，荧光强度增强约21倍；本专利技术的荧光探针与0
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10U/mL弹性蛋白酶的具有良好的线性关系，可用于低浓度的定性定量实验；还可应用于活细胞和斑马鱼模型中内源性的弹性蛋白酶检测和成像。荧光探针(I)与弹性蛋白酶响应后的产物(II)具有绿荧光，并在535nm处的荧光强度逐渐增加，属于荧光增强型荧光探针，该产物的分子式为C
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针，其特征在于，其分子式为C
18
H
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F5N2O3，其结构式如式(I)所示，2.一种如权利要求1所述的大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.以8
‑
羟基久洛尼定
‑9‑
甲醛及硝基乙酸乙酯为原料，于溶剂中加热回流反应，经分离纯化，得到第一中间体；S2.在酸性条件下，以氯化亚锡二水合物及所述第一中间体为原料，搅拌反应后，经分离纯化，得到第二中间体；S3.在吡啶存在条件下，以所述第二中间体及五氟丙酸酐为原料，于溶剂中，搅拌反应，经分离纯化后，即得所述荧光探针；其合成路线如下：3.根据权利要求2所述的大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述8
‑
羟基久洛尼定
‑9‑
甲醛与硝基乙酸乙酯的摩尔比为1:1
‑
2。4.根据权利要求2所述的大斯托克斯位移检测弹性蛋白酶的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述氯化亚锡二水合物与第一中间体的摩尔比为3
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙琦，李想，郭芸，刘婷婷，罗晓刚，
申请(专利权)人：武汉工程大学，
类型：发明
国别省市：