一种简单快速、低成本、高通量的肌肉质量测量方法及检测试剂盒技术

本申请公开了一种简单快速、低成本、高通量的肌肉质量测量方法、计算器及肌肉质量检测试剂盒，包括以下步骤：(1)被测对象服用d3肌酸水溶液；(2)采集被测对象尿液样品；(3)尿液样品处理：在被测对象尿液样品中加入稀释剂稀释；(4)取上清液进样分析，获取肌酐响应值和D3肌酐响应值：分析采用液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种简单快速、低成本、高通量的肌肉质量测量方法及检测试剂盒


[0001]本申请属于临床生物标志物检测领域，涉及肌肉质量测量，具体地，涉及一种简单快速、低成本、高通量的肌肉质量测量方法、计算器及肌肉质量检测试剂盒。

技术介绍

[0002]肌肉减少症简称“肌少症”，指一种以骨骼肌力量和质量的进行性和广泛性降低为特征的综合征。与骨质疏松症等疾病相比，肌少症受重视程度相对较低。有研究报道，人类的肌肉质量从20岁开始到90岁将会持续下降，可能会降低大约50％，特别从50岁开始，会以每十年15％的速度流失，70岁之后降低的速度达到每十年30％。因此，5％～30％的60岁以上老人、11％～50％的80岁以上老人会发生不同程度的肌少症，此外，营养不良和患慢性病的人亦可能患肌少症。肌少症的发生可影响病人各种生理功能，导致病人的身体能力和生活质量低下，增加跌倒、骨折、住院、致残等风险，还会影响多种疾病的发生发展及预后，给社会带来重大负担。随着世界人口老龄化加剧，肌少症已成为全球关注的健康问题。
[0003]随着人口老龄化程度加深，肌少症的早期筛查诊断在临床和公共卫生领域均具有重要意义。肌少症的早期诊断主要基于骨骼肌质量的测量，尽管肌肉质量检测已有广泛的影像学基础，如CT、MRI、双能X射线吸收法(DXA)、生物电阻抗法(BIA)等，这些技术的固有局限性阻碍了其快速、灵敏、精准的客观测量。CT、MRI成像技术被作为评估人体成分的金标准方法，常用于测定肌肉质量，但两者在肌少症领域的应用受到成本高、耗时长、灵敏度低、无法批量分析等限制，且会在体内水量变化时发生测量错误，CT还有辐射暴露风险。DXA有相对较低的成本、低辐射暴露、较短的扫描时间等优点，在多个指南中得到推荐，成为肌少症相关研究和临床实践中使用最广泛的方法，但DXA检测的是四肢瘦软组织，包括肌肉质量、水分以及一些非脂肪软组织，可能高估了肌肉质量，尤其对于细胞外积液患者。BIA亦是如此，其结果不是肌肉的直接量度，而是基于单独的身体抵抗力参数，可能受多种因素的影响。
[0004]学者们一直在寻找一种能直接反应肌肉质量的生物标志物。24h尿肌酐排泄成为研究最多的生物标志物测量法，它基于肌酸和肌酐的生物学原理，认为尿中肌酐的产生和排泄与肌肉中肌酸池的大小直接相关，可通过肌酸池的大小来确定肌肉质量。该法已被学者们研究并应用，然而完整收集24h内排泄的尿液总量实施困难，被采集人群的依从性差，过程中的容错率低，尿样采集的缺失会降低肌肉质量的估计值；此外，受试者必须严格控制饮食，因为食用含肌酸的食物会导致全身肌肉质量的高估。基于此，需要一种实操性更强、能保证获得精确测量结果的技术，实现灵敏、简单、快速、无损、低成本、精准和可标准化的肌肉质量测定，并用于肌少症早期诊断筛查。
[0005]学者们将目光转向了基于24h尿肌酐排泄法的同位素肌酸稀释法，该法早在1970年就有学者提出，但因当时技术限制而未得到进一步研究和应用。Evans课题组验证了同位素肌酸稀释法，通过测量尿中D3
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肌酐的稳态富集可计算人体的肌酸池大小，进而得到全身
肌肉质量，D3肌酸稀释法肌肉质量计算如公式(I
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III)。与其他方法相比，该方法不依赖于严格、完整的尿液收集，仅需要给药后在稳态期间采集单点尿液样品，具有无辐射危险、受试者依从性好、成本低、可实现灵敏快速和批量分析等优点。因此，同位素肌酸稀释法有望成为肌肉质量的常规测量方法，还能用于肌少症早期诊断、以及监测疾病和治疗中肌肉质量的变化。
[0006]MPE计算公式为：
[0007][0008]肌酸池大小计算公式为：
[0009][0010]SMM计算公式为：
[0011][0012]根据国内外现有资料，同位素肌酸稀释法测定肌肉质量的研究极少，文献量不足20篇，且在现有报道中，须对D3肌酐、肌酐和D3肌酸进行准确定量，但对定量测定方法极少有详细描述和探讨，难以保证其准确度和可比性。目前D3肌酸和肌酐的测定均采用高效液相色谱质谱法，在测定中尿样的基质效应是影响准确度和灵敏度的严重问题。报道中多采用同位素内标校正，但对于此测量，待测物为同位素标记的物质，因此适合的同位素内标很难获得，经济成本极高，且同位素内标校正亦无法消除基质效应带来的灵敏度损失。也有采用萃取净化样品或基质匹配法校正，但复杂的程序不适用于临床实践。这些因素成为推广该法的严重障碍。此外，如上述公式所示，现有报道在测量肌酸池大小时，需要明确D3肌酸实际进入肌酸池的量，即要得到D3肌酸累积漏出量，这意味着要对尿中D3肌酸进行准确定量，并且需要完整收集给药后到稳态期间单点尿液样品采集这一时间段的尿样，并进行尿样体积的准确量化。显然，这样的尿样采集要求以及分析要求会在一定程度降低受试者的依从性以及增大实验的繁琐性和测定结果的不确定性。在这种背景下，迫切需要建立一种快速、灵敏、高效的方法，用于临床检测领域，操作简单易行，可准确测定肌肉质量，病人依从性高，检测流程可标准化，以实现批量分析和肌少症病人的早期诊断筛查，现有文献报道中尚未有很好的解决办法。
[0013]上述
技术介绍
是为了便于理解本申请，并非是本申请之前已向普通公众公开的公知技术。

技术实现思路

[0014]基于上述问题，本申请提供一种简单快速、灵敏、可标准化的适合临床批量样品分析的肌肉质量测定方法，能用于肌少症病人的早期诊断筛查。该方法有效解决了现有分析方法样品前处理繁琐、耗时长、成本高、需要对尿液体积量化以计算肌酸漏出等问题，提高了检测时效和准确性。
[0015]一种简单快速、低成本、高通量的肌肉质量测量方法，包括以下步骤：
[0016](1)被测对象服用d3肌酸水溶液；
[0017](2)采集被测对象尿液样品；
[0018](3)尿液样品处理：在被测对象尿液样品中加入稀释剂稀释；
[0019](4)取上清液进样分析，获取肌酐响应值和D3肌酐响应值：分析采用液相色谱
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串联质谱法分析；
[0020](5)进行肌肉质量计算，计算公式为：
[0021][0022][0023][0024]得肌肉质量SMM，其中校正系数为3
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5。
[0025]在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述(1)中，d3肌酸水溶液为用纯度≥99％的d3肌酸用无菌超纯水稀释配制为0.5mg/mL或1.0mg/mL浓度的溶液。
[0026]在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述(1)中，按照0.5mg/kg.bw或1.0mg/kg.bw剂量单次给予肌酸水溶液。
[0027]在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述(2)中，采集被测对象尿液样品为服用D3
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肌酸后30h～72h的被测对象的随机尿液。
[0028]在本申请的一个或多个具体的实施方式中，所述(3)中，稀释剂为水、乙腈、乙腈
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水、甲醇、甲醇
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水、甲醇
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种简单快速、低成本、高通量的肌肉质量测量方法，包括以下步骤：(1)被测对象服用d3肌酸水溶液；(2)采集被测对象尿液样品；(3)尿液样品处理：在被测对象尿液样品中加入稀释剂稀释；(4)取上清液进样分析，获取肌酐响应值和D3肌酐响应值：分析采用液相色谱
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串联质谱法分析；(5)进行肌肉质量计算，计算公式为：(5)进行肌肉质量计算，计算公式为：(5)进行肌肉质量计算，计算公式为：得肌肉质量SMM，其中校正系数为3
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5。2.根据权利要求1所述的简单快速、低成本、高通量的肌肉质量测量方法，其特征在于，所述(1)中，d3肌酸水溶液为用纯度≥99％的d3肌酸用无菌超纯水稀释配制为0.5mg/mL或1.0mg/mL浓度的溶液。3.根据权利要求1
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2任一所述的简单快速、低成本、高通量的肌肉质量测量方法，其特征在于，所述(1)中，按照0.5mg/kg.bw或1.0mg/kg.bw剂量单次给予肌酸水溶液。4.根据权利要求1
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3任一所述的简单快速、低成本、高通量的肌肉质量测量方法的建立方法，其特征在于，所述(2)中，采集被测对象尿液样品为服用D3
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肌酸后30h～72h的被测对象的随机尿液。5.根据权利要求1
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4任一所述的简单快速、低成本、高通量的肌肉质量测量方法，其特征在于，所述(3)中，稀释剂为水、乙腈、乙腈
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水、甲醇、甲醇
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水、甲醇
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乙酸缓冲液、乙腈
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乙酸铵溶液中的一种或多种。6.根据权利要求1
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5任一所述的简单快速、低...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹晓莉，杨茗，罗新月，蒋佼佼，赵璇，郑波，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：