效价可控的噬菌体辅助进化方法技术

本发明专利技术公开了一种效价可控的噬菌体辅助进化方法，根据携带待进化目标基因的噬菌体的初始效价，确定合适的噬菌体辅助进化方法。本发明专利技术针对不同特定功能生物分子本底活性采用不同的噬菌体辅助进化系统，解决了生物分子进化中所带来的由于初始表达水平过高导致难以筛选出具有更高特定活性的生物分子和低初始活性本地表达水平过低导致无法进行多轮进化问题。问题。问题。

【技术实现步骤摘要】
效价可控的噬菌体辅助进化方法


[0001]本专利技术涉及一种效价可控的噬菌体辅助进化方法，涉及生物进化领域。

技术介绍

[0002]定向进化是一种蛋白、核酸序列进化的一种方法，具有效率高、特异性高的特点；可以使用生物生物进化的过程产生具有特定功能的生物分子，所生产的生物分子广泛运用于生物工程、医药工程、工业生产等领域。2011年，哈佛大学刘如谦团队开发出一种基于噬菌体生长的定向进化系统，分为基于噬菌体辅助连续进化系统(PACE)和基于噬菌体辅助非连续进化系统(PANCE)。该系统中主要包含噬菌体模块、诱变模块、辅助模块；其中噬菌体模块通过对噬菌体gⅢ基因序列的切除，插入待进化生物分子基因序列，由于gⅢ基因的缺失，无法使用通过改造后的噬菌体基因组自身进行子代的繁殖；其中诱变模块具有如lacI、araC等作为诱导物进行低保真聚合酶、甲基化酶、脱氨酶等易造成高突变的酶表达；辅助模块通过含有gⅢ基因序列与所需要的进化的生物分子基因的生物分子活性进行捆绑(如待进化的生物分子为T7聚合酶，则辅助模块的gⅢ则与T7启动子序列捆绑，具有功能活性的T7聚合酶序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MBP
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PANCE噬菌体辅助进化方法，其特征在于其步骤包括：(1)构建噬菌体进化系统，包括携带待进化目标基因的噬菌体M13、宿主菌一以及宿主菌二，所述噬菌体M13的gIII基因被切除，所述宿主菌一中含有增殖辅助质粒175e，所述增殖辅助质粒175e携带gIII基因，在噬菌体M13进入含有175e的宿主菌一后，启动gⅢ基因；所述宿主菌二中含有诱导突变的质粒DP6+，所述诱导突变的质粒DP6+携带突变诱导基因、gⅢ基因，以及与gⅢ基因耦合的引导待进化目标基因表达的基因，阿拉伯糖启动子启动所述突变诱导基因的表达，该gⅢ基因受tet操纵子操纵；(2)将携带待进化目标基因的噬菌体M13转化到宿主菌一中，加入宿主菌二，获得初代进化液，添加诱导剂进行诱导突变一段时间后，在初代进化液中添加tet使gIII基因表达，进行噬菌体包装，获得初代包装液；取二代进化液的菌液加入宿主菌二，获得二代进化液，重复上述诱导突变
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包装的过程，以获得相较于初始的噬菌体M13效价滴度更高的突变体。2.根据权利要求1所述的MBP
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PANCE噬菌体辅助进化方法，其特征在于，所述目标基因为T7RNA聚合酶，所述引导待进化目标基因表达的基因为T7 promoter。3.根据权利要求1所述的MBP
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PANCE噬菌体辅助进化方法，其特征在于，所述目标基因为内含肽，所述引导待进化目标基因表达的基因为内含肽C端氨基酸的编码基因。4.根据权利要求1所述的MBP
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PANCE噬菌体辅助进化方法，其特征在于，所述DP6+携带的突变诱导基因为DNAQ926、dam、seqA、emrR、UGI、PmCDA1基因。5.根据权利要求1所述的MBP
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PANCE噬菌体辅助进化方法，其特征在于，步骤(2)中在进行诱导突变前，先对进化液进行效价滴定，使进化液的滴度控制在106～107pfu/ml。6.一种AP
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PANCE噬菌体辅助进化方法，其特征在于其步骤包括：(1)构建噬菌体进化系统，包括携带待进化目标基因的噬菌体M13、宿主菌一以及宿主菌三，所述噬菌体M13的gIII基因被切除，所述宿主菌一中含有增殖辅助质粒175e，所述增殖辅助质粒175e携带gIII基因，在噬菌体M13进入含有175e的宿主菌一后，启动gⅢ基因；所述宿主菌三中含有增殖辅助质粒175e+和诱导突变的质粒DP6+，所述增殖辅助质粒175e+携带耦合的gIII基因以及引导待进化目标基因表达的基因，所述诱导突变的质粒DP6+携带突变诱导基因、gⅢ基因，以及与gⅢ基因耦合的引导待进化目标基因表达的基因，阿拉伯糖启动子启动所述突变诱导基因的表达，该gⅢ基因受tet操纵子操纵；(2)将携带待进化目标基因的噬菌体M13转化到宿主菌一中，加入宿主菌三，获得初代进化液，添加诱导剂进行诱导突变一段时间后，在初代进化液中添加tet使gIII基因表达，进行噬菌体辅助包装，获得初代辅助包装液；取初代辅助包装液的菌液加入宿主菌三，获得二代进化液，重复上述诱导突变
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辅助包装的过程，以获得相较于初始的噬菌体M13效价滴度更高的突变体。7.根据权利要求6所述的AP
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PANCE噬菌体辅助进化方法，其特征在于，所述目标基因为T7RNA聚合酶，所述引导待进化目标基因表达的基因为T7 promoter。8.根据权利要求6所述的AP
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PANCE噬菌体辅助进化方法，其特征在于，所述目标基因为内含肽，所述引导待进化目标基因表达的基因为内含肽C端氨基酸的编码基因。9.根据权利要求6所述的AP
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PANCE噬菌体辅助进化方法，其特征在于，所述DP6+携带的
突变诱导基因为DNAQ926、dam、seqA、emrR、UGI、PmCDA1基因。10.根据权利要求6所述的MBP
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PANCE噬菌体辅助进化方法，其特征在于，步骤(2)中在进行诱导突变前，先对进化液进行效价滴定，使进化液的滴度控制在106～107pfu...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗元廷，江翱，张志乾，吴奕瑞，胡玉成，刘丽花，
申请(专利权)人：广州市乾相生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：