一种流式荧光抗体纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种流式荧光抗体纯化方法，包括以下步骤：S1、抗体修饰：配制1

【技术实现步骤摘要】
一种流式荧光抗体纯化方法


[0001]本专利技术涉及免疫学
，具体为一种流式荧光抗体纯化方法。

技术介绍

[0002]传统的流式抗体，由单克隆抗体和荧光蛋白偶联而成，可特异性地与细胞抗原结合，在流式细胞仪上荧光蛋白被激光激发后，发射光通过特定滤光片到达相应的检测通道，从而测定阳性细胞群的比例和/或绝对数量。当前流式抗体的标记，普遍采用以SMCC、SPDP等作为交联剂，通过含N
‑
羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)的交联剂与蛋白上的伯胺反应、二硫键还原为巯基后与马来酰亚胺交联的方法，将单克隆抗体与荧光蛋白偶联在一起。
[0003]在反应中，由于荧光染料的摩尔量大于抗体，且反应并不充分，依然有部分抗体无法被标记上荧光染料。反应后的溶液中，存在已偶联的荧光蛋白
‑ꢀ
单克隆抗体、未反应的抗体和未反应的荧光蛋白，需要进行分离纯化，去除未反应的抗体和荧光染料。
[0004]专利CN112098640A提供了一种荧光蛋白和/或偶联蛋白单克隆抗体标记方法及其试剂盒，采用以SMCC和SPDP作为交联剂，以TCEP作为还原剂，将二硫键还原为巯基的方法，对多种荧光蛋白进行标记，包括PERCP、PE、PECy5、 PECy5.5、PECy7、PerCPCy5.5、APCCy5.5、APCCy7和APC。专利CN109883932 提供了一种APC标记流式抗体的方法，采用以SMCC作为交联剂，以DTT作为还原剂，将二硫键还原为巯基的方法。专利CN111044732公布了一种流式细胞仪法CD45抗原检测的试剂盒和制备方法，以SMCC和SPDP作为交联剂，以 DTT或TCEP等作为还原剂，将多种荧光蛋白应用于CD45抗体的标记。然而这些专利在标记后均未进行分离纯化，存在未反应的抗体、荧光蛋白，无法对标记的抗体进行准确定量，导致不同批次间无法采用可量化的标准进行生产，同时对抗体染色的特异性也会造成潜在的影响。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种流式荧光抗体纯化方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种流式荧光抗体纯化方法，包括以下步骤：
[0007]S1、抗体修饰：
[0008]E、配制1
×
修饰缓冲液：0.1MNa3PO4、0.15MNaCl、1mMEDTA，pH8.0；
[0009]F、称量适量的SANH，溶于DMF，配成10mg/ml的SANH溶液；
[0010]G、取1mg待标记的抗体，加入经1
×
修饰缓冲液制备的脱盐柱中，于室温1000
×
g离心2分钟，收集滤液，重复一次，置换为1
×
修饰缓冲液；
[0011]H、按摩尔比1:20
–
1:80，在抗体中加入适量SANH溶液，混匀后于室温避光孵育1
‑
2小时；
[0012]S2、荧光蛋白修饰：
[0013]E、称量适量的SFB，溶于DMF，配制10mg/ml的SFB溶液；
[0014]F、取适量荧光蛋白，用1
×
修饰缓冲液将浓度调整为5
‑
10mg/ml。此处的荧光蛋白，包括R
‑
PE、APC、PE
‑
Cy5、PE
‑
Cy7、APC
‑
Cy7、PerCP、PerCP
‑
Cy5.5；
[0015]G、将荧光蛋白加入经1
×
修饰缓冲液制备的脱盐柱中，于室温1000
×
g 离心2分钟，收集滤液，重复一次，置换为1
×
修饰缓冲液；
[0016]H、按摩尔比1:20
‑
80，在荧光蛋白中加入适量SFB溶液，混匀后于室温避光孵育1
‑
2小时；
[0017]S3、偶联：
[0018]F、配制1
×
标记缓冲液：0.1MNa3PO4、0.15MNaCl、1mMEDTA，pH6.0；
[0019]G、配制10
×
催化缓冲液：0.1MNa3PO4、0.15MNaCl、1mMEDTA、100mM苯胺，pH6.0；
[0020]H、将修饰后的抗体和荧光蛋白分别加入经1
×
标记缓冲液制备的脱盐柱中进行脱盐，于室温1000
×
g离心2分钟，收集滤液，重复一次，置换为1
ꢀ×
标记缓冲液；
[0021]I、将脱盐后的抗体和荧光蛋白滤液合并，按体积比加入1/10的10
×
催化缓冲液；
[0022]J、混匀后于室温避光孵育1
‑
2小时；
[0023]S4、纯化：
[0024]B、将反应后的抗体加入1
×
PBS制备的脱盐柱中进行脱盐，置换为1
×ꢀ
PBS；
[0025]B、使用与目的产物和需分离的未反应抗体和荧光蛋白分子量相匹配的体积排阻色谱纯化柱，于蛋白纯化仪上进行分离纯化，收集目标峰；
[0026]S5、纯度鉴定：
[0027]利用体积排阻色谱分析柱在HPLC上进行纯度分析。
[0028]优选的，所述S5中体积排阻色谱分析柱采用SEC
‑
300。
[0029]优选的，所述S4步骤B中体积排阻色谱纯化柱采用HiLoad16/600Superdex200pg。
[0030]优选的，所述S1步骤C和S2步骤C中离心使用可调式常温过滤离心机，离心机转速为500
‑
1700r/min。
[0031]优选的，所述S1、S2和S3中缓冲液为醋酸铵缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、乌洛托品缓冲液、巴比妥缓冲液、甲酸钠缓冲液、枸橼酸盐缓冲液和氯化铵缓冲液中的一种或几种的混合。
[0032]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0033]通过抗体修饰、荧光蛋白修饰、偶联、纯化和纯度鉴定制备后纯度高：通过体积排阻法，去除未反应的荧光蛋白和抗体，可得到高纯度的荧光蛋白
‑ꢀ
单克隆抗体。
[0034]可定量：可对标记抗体进行浓度测定，保持批次间的一致性。
附图说明
[0035]图1为本专利技术中纯化峰值的对比结构示意图之一；
[0036]图2为本专利技术第一种商品化对照试剂中的对比示意图；
[0037]图3为本专利技术的第一种纯化的标记抗体的对比示意图；
[0038]图4为本专利技术中标记抗体的检测示意图；
[0039]图5为本专利技术中纯化峰值的对比结构示意图之二；
[0040]图6为本专利技术中第二种商品化对照试剂的对比示意图；
[0041]图7为本专利技术中第二种纯化的标记抗体的对比示意图；
[0042]图8为本专利技术中HPLC鉴定的检测纯度示意图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种流式荧光抗体纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、抗体修饰：A、配制1
×
修饰缓冲液：0.1MNa3PO4、0.15MNaCl、1mMEDTA，pH8.0；B、称量适量的SANH，溶于DMF，配成10mg/ml的SANH溶液；C、取1mg待标记的抗体，加入经1
×
修饰缓冲液制备的脱盐柱中，于室温1000
×
g离心2分钟，收集滤液，重复一次，置换为1
×
修饰缓冲液；D、按摩尔比1:20
–
1:80，在抗体中加入适量SANH溶液，混匀后于室温避光孵育1
‑
2小时；S2、荧光蛋白修饰：A、称量适量的SFB，溶于DMF，配制10mg/ml的SFB溶液；B、取适量荧光蛋白，用1
×
修饰缓冲液将浓度调整为5
‑
10mg/ml。此处的荧光蛋白，包括R
‑
PE、APC、PE
‑
Cy5、PE
‑
Cy7、APC
‑
Cy7、PerCP、PerCP
‑
Cy5.5；C、将荧光蛋白加入经1
×
修饰缓冲液制备的脱盐柱中，于室温1000
×
g离心2分钟，收集滤液，重复一次，置换为1
×
修饰缓冲液；D、按摩尔比1:20
‑
80，在荧光蛋白中加入适量SFB溶液，混匀后于室温避光孵育1
‑
2小时；S3、偶联：A、配制1
×
标记缓冲液：0.1MNa3PO4、0.15MNaCl、1mMEDTA，pH6.0...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭爱龙，元卿，李娜，
申请(专利权)人：杭州九盛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：