一种山核桃寡核苷酸探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种山核桃(Carya cathayensis Sarg.)寡核苷酸探针及其应用。本发明专利技术首次为山核桃(Carya cathayensis Sarg.)成功开发了经济高效且通用性强的寡核苷酸探针，填补山核桃属植物染色体物理标记为零的空白；并应用开发的寡核苷酸探针对包括山核桃(Carya cathayensis Sarg.)在内的7个不同山核桃种染色体结构进行分析，并利用所开发的OligoSHT

【技术实现步骤摘要】
一种山核桃寡核苷酸探针及其应用


[0001]本专利技术涉及寡核苷酸探针
，具体涉及一种山核桃(Carya cathayensis Sarg.)寡核苷酸探针及其应用。

技术介绍

[0002]山核桃属(Carya Nutt)是胡桃科(Juglandaceae)的一个重要的属，是珍贵的经济林树种，具有极高经济价值，特别是其中的山核桃(Carya cathayensis Sarg.)和薄壳山核桃(Carya illinoinensis)，在浙江省干果产业中占有极其重要的地位。山核桃属包括约18个种，分为北美山核桃种和东亚山核桃种两大组，其中北美山核桃种约12个种，包括薄壳山核桃(Carya illinoinensis)、卵形山核桃 (Carya ovata)及弗罗里达山核桃(Carya floridana)等，主要分布在北美；东亚山核桃种约 6个种，包括山核桃(Carya cathayensis Sarg.)、云南山核桃(Carya tonkinensis Lecte)、湖南山核桃(Carya hunanensis)、大别山山核桃(Carya dabieshanensis)、贵州山核桃(Caryakweichowensis)和喙核桃(Carya sinensis)，分别分布于浙江、云南、湖南、安徽及贵州等省的偏远山区。
[0003]部分山核桃种的细胞学研究结果表明，山核桃属植物中，约有8个山核桃种为二倍体，6 个山核桃种为四倍体，存在明显的染色体数目变异。在6个东亚山核桃种中，除喙核桃染色体数目尚无报道外，其余5个山核桃种染色体数目均为2n＝32，且基因组大小相差也不明显。一些研究表明，45S rDNA在一些山核桃种染色体上的分布位置具有明显的杂合性，不同个体间存在异质性，例如山核桃(Carya cathayensis Sarg.)染色体上有3个45S rDNA位点分布，其中2个位点以成对的形式分布在1对同源染色体上，而另外1个位点仅单独分布在1条染色体上，另一条同源染色体未见明显信号，推测山核桃(Carya cathayensis Sarg.)基因组演化中涉及染色体结构变异，同时涉及染色体杂合性和异质性，因此揭示一些山核桃种的染色体变异特点，对于发掘和利用其遗传多样性开展山核桃属遗传改良以及准确基因组测序与组装具有重要的参考价值。但是，由于传统细胞遗传学技术的局限性，山核桃属细胞遗传学研究缺乏必要的探针资源，山核桃属植物染色体数目较多，且染色体形态较小，一些染色体极易断裂，染色体断片与一些小染色体在形态上非常相似，极难区分，没有相应的染色体物理标记作辅助，很难对山核桃属植物染色体进行深入研究，限制了山核桃属染色体研究及染色体工程的开展。可以说山核桃属植物染色体物理标记的匮乏已成为制约山核桃属植物细胞遗传学发展的技术瓶颈。因此，山核桃属植物染体物理标记开发工作迫在眉睫。
[0004]山核桃属植物普遍存在多胚现象，这种多胚现象不是简单的裂生多胚，其中，湖南山核桃(Carya hunanensis)种子的多胚现象较为普遍，一般有2至8个胚根，多胚率高达80％以上，山核桃(Carya cathayensis Sarg.)种子也存在较高的多胚率，主要以2胚和3胚现象出现。一些研究表明，多胚与无融合生殖之间具有密切的相关性。研究表明，山核桃属植物中存在一定的无融合生殖现象，山核桃(Carya cathayensis Sarg.)解剖学研究结果表明，山核桃(Caryacathayensis Sarg.)雌配子体发育正常，但在大量组织切片中没有发
现合子胚，成熟胚均来源于珠心胚，因而一些研究者推测山核桃(Carya cathayensis Sarg.)可能属于专性无融合生殖。还有一些研究者利用RAPD、SRAP等分子标记及无融合生殖连锁分析模型等手段对山核桃(Carya cathayensis Sarg.)进行分析，认为山核桃(Carya cathayensis Sarg.)不是专性无融合生殖，而属于兼性无融合生殖，无融合生殖比例约30％，另外还有一些研究者认为，山核桃(Carya cathayensis Sarg.)无融合生殖比率较低，约20％左右。由于目前在山核桃(Caryacathayensis Sarg.)无融合生殖鉴定方面还没非常有效的方法，山核桃(Carya cathayensis Sarg.) 究竟属于兼性无融合生殖还是专性无融合生殖依然不是很清晰。无融合生殖是一种不经雌雄配子结合而产生后代的无性生殖方式，因此理论上无融合生殖植物的二倍体子代的基因型与母本基因型完全相同，因此可通过后代与母本之间的基因分离情况来鉴定无融合生殖。根据经典遗传学分离定律，假设母本具有一对等位基因Aa，经有性生殖后，其子代对应的基因型主要表现为AA、Aa和aa三种类型，且基因型满足AA:Aa:aa＝1:2:1比例关系，如果是无融合生殖，则子代的基因始终为Aa。因此若有合适的染色体物理标记，根据相应染色体物理标记在一些染色体上的分布特征，也可为山核桃(Carya cathayensis Sarg.)植物无融合生殖鉴定提供一个有效的方法。
[0005]寡核苷酸荧光原位杂交技术(Oligonucleotide fluorescence in situ hybridization, Oligo
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FISH)是一项新的荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)，该技术以长约几十碱基的单链寡核苷酸为探针，可实现对基因组、染色体和特定染色体区段的精确鉴定，具有简单、经济和高效的特点。根据序列来源特点寡核苷酸探针可分为单拷贝序列寡核苷酸探针和重复序列寡核苷酸探针两种类型，其中，单拷贝序列寡核苷酸探针主要依据一些染色体序列信息进行设计和开发，目前黄瓜(Cucumis)、水稻(Oryza sativa L.)及马铃薯 (Solanum bulbocastanum)等已实现单条染色体单拷贝寡核苷酸探针库的开发及染色体涂染；重复序列寡核苷酸探针主要基于对植物全基因组测序序列的生物信息学分析，根据高度重复的串联重复序列核心元件进行设计和开发，目前小麦(Triticum aestivum L.)、花生(Arachishypogaea L.)和人参(Panax ginseng)等物种已有很多报道，并在染色体研究和染色体工程育种领域得到大量利用。目前，山核桃(Carya cathayensis Sarg.)已完成全基因组测序工作，为山核桃(Carya cathayensis Sarg.)寡核苷酸探针开发工作奠定了非常好的前期分子生物学基础。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种山核桃(Carya cathayensis Sarg.)寡核苷酸探针及其应用，以解决现有技术的不足。
[0007]本专利技术采用以下技术方案：
[0008]本专利技术第一方面提供了一种山核桃(Carya cathayensis Sarg.)寡核苷酸探针，选自以下六种探针中的一种或多种，所述六种探针本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种山核桃(Carya cathayensis Sarg.)寡核苷酸探针，其特征在于，选自以下六种探针中的一种或多种，所述六种探针具体为：探针OligoSHT
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2，如SEQ ID NO:1所示：GCCCGTGGGGCTTGTCAGGGTCAGGGGCAGTGTCAGGGCATG探针OligoSHT
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3，如SEQ ID NO:2所示：CATGTGCCCGTGGGGCTTGTCAGGGTCAGGGGCAGTGTCAAGGGGCATGC探针OligoSHT
‑
4，如SEQ ID NO:3所示：CAGTGTCAGGGCATGGCCCGTGGGGCTTGTCAGGGTCAGGGG探针OligoSHT
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5，如SEQ ID NO:4所示：CAGGGGCAGTGTCAAGGGGCATGCCATGGTGCCCGTGGGGCTTGTCAAGGT探针OligoSHT
‑
5S由3条不同的探针序列组成：OligoSHT
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5S
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1，如SEQ ID NO:5所示：TGCGATCATACCAGCACCAATGCACCGGATCCCATTAGAACTCCGCAGTTAAGCGTGOligoSHT
‑
5S
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2，如SEQ ID NO:6所示：TGCTTGGGCGAGAGTAGTACTAGGATGGGTGACCTCCTGGGAAGTCCTCGTGTTGCAOligoSHT
‑
5S
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3，如SEQ ID NO:7所示：TGCGATCGTACCAGCACTAATGCATCGGATCCCATCAGAACTCCGCAGTTAAGCGTG探针OligoSHT
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45S由8条不同的探针序列组成：OligoSHT
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45S
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1，如SEQ ID NO:8所示：TTAACCAGACAAATCGCTCCACCAACTAAGAACGGCCATGOligoSHT
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45S
‑
2，如SEQ ID NO:9所示：GAAACCTTGTTACGACTTCTCCTTCCTCTAAATGATAOligoSHT
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45S
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3，如SEQ ID NO:10所示：GCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAGTCAAOligoSHT
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45S
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4，如SEQ ID NO:11所示：TTAACCAGACAAATCGCTCCACCAACTAAGAACGGCCATGOligoSHT
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45S
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5，如SEQ ID NO:12所示：TGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCOligoSHT
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45S
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6，如SEQ ID NO:13所示：TGGTCGGCATCGTTTATGGTTGAGACTAGGACGGTATCTGOligoSHT
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45S
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7，如SEQ ID NO:14所示：GGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGOligoSHT
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45S
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8，如SEQ ID NO:15所示：TTCATACTTACACATGCATGGCTTAATCTTTGAGAC。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐川梅，黄坚钦，王克涛，苑轲，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：