一种快速简便的果胶酶活性检测方法技术

本发明专利技术涉及果胶酶活性检测技术领域，公开了一种快速简便的果胶酶活性检测方法，包括待测样品处理阶段，该阶段包括，S1、反应：果胶酶对果胶分解反应获得溶液I；S2、扩散：溶液I在滤纸上扩散并测距获得扩散距离。本方案根据反应后的溶液在滤纸上的扩散结果即可检测果胶酶的活性，其设备简单、用材简单，使得本方案检测更方便、成本更低。同时，本方案所用检测方法的灵敏度更高(定量限为0.005单位)、检测范围更广(0.005

【技术实现步骤摘要】
一种快速简便的果胶酶活性检测方法


[0001]本专利技术涉及果胶酶活性检测
，具体涉及一种快速简便的果胶酶活性检测方法。

技术介绍

[0002]植物细胞壁由多种蛋白质和含有碳和氮的复合多糖组成，包括纤维素、半纤维素和果胶，它们作为物理屏障防止外来微生物入侵。果胶酶(PG，亦称多聚半乳糖醛酸酶)是由细菌、真菌和酵母菌等不同微生物自然产生的一种水解酶，作用于果胶的聚半乳糖醛酸，使α
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1,4
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糖苷键断裂，促进果胶的降解感染宿主组织。在微生物感染宿主组织的早期阶段，PG对于不具有任何特定穿透结构的病原微生物至关重要；果胶酶含量的测定对于预测微生物感染宿主组织具有重要的作用。此外，PG也因其越来越多的生物技术应用而引起业界的极大兴趣，从果汁和葡萄酒的提取澄清到天然纤维的浸解、咖啡和茶的发酵、废水处理和棉花生物精炼等，均涉及对果胶酶的应用。因此，检测PG活性不仅能对宿主组织是否感染微生物进行预测，还能对植物的各种应用打下理论基础，为追求作物高产的农民、追求高品质产品的消费者等均具有重要指导意义。
[0003]目前用于测定PG活性的常规方法是粘度测定法和比色法。其中，粘度测定法为利用连接到检测器系统的粘度计来比较酶促反应前后溶液粘度的变化。然而，粘度测定法需要昂贵的粘度计和熟练的操作员，且因为其检测结果为范围值，准确性较低，使得在测量过程中需要重复清洗和校准，非常麻烦。再者，粘度测定法还需要较长的测定时间和较高的试剂/样品体积消耗，使得检测成本非常高。另外，比色法则是基于PG作用于果胶过程中产生的还原糖末端数量的变化而检测果胶酶活性。常用的比色法有二硝基水杨酸试剂法、砷钼酸铜试剂法、钌红染料法等。这些比色法均为基于显色材料前体与还原糖反应产生响应色而检测酶活性，如二硝基水杨酸与还原糖反应产生橙色3
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氨基
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硝基水杨酸产物、砷钼酸铜与还原糖反应生成蓝色钼蓝产品等。然而，比色法仍然存在如下缺点：(1)样品中自身具有高还原力的物质和其他酶均会影响显色，从而干扰PG的测定，进而使得测结果不准确；(2)样品中本身存在的大量还原糖会严重影响由PG产生的少量还原糖的检测，从而干扰低水平PG的测定；(3)实验取用的有色样品也会干扰显色，从而影响PG检测的显色判断，从而降低PG活性检测的准确率；(4)比色法检测方法需要较长的测定时间、大量的试剂和样品以及多步骤的分析过程，使得检测成本高、流程复杂、结果准确率较低，对检测方法的使用场景非常局限。因此，迫切需要开发一种简便、便携、经济高效、灵敏度高、选择性好的PG快速检测方法，可以有效弥补现有PG检测方法的不足，对以PG活性检测为基础的诊断、检测具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术意在提供一种快速简便的果胶酶活性检测方法，以解决现有果胶酶活性检测成本较高的技术问题。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种快速简便的果胶酶活性检测方法，包括待测样品处理阶段，该阶段包括，S1、反应：果胶酶对果胶分解反应获得溶液I；S2、扩散：溶液I在滤纸上扩散并测距获得扩散距离。
[0006]本方案的原理是：
[0007]依据不容浓度的果胶酶分解果胶而得的产物溶液粘度不同，且不同粘度溶液在滤纸上的扩散结果不同的原理，本方案将果胶溶液经不同活性果胶酶标准溶液水解，获得不同粘度的反应溶液，再将不同粘度的反应溶液在滤纸上扩散得到不同扩散结果的滤纸，最后通过对不同扩散结果的滤纸进行定量分析以检测果胶酶的活性。
[0008]本方案的优点是：
[0009]1、与现有技术中果胶酶的检测成本均较高相比，本方案根据反应后的溶液在滤纸上的扩散结果即可用于后续检测果胶酶的活性，其设备简单、用材简单，使得本方案检测更方便、成本更低。申请人实验证明，本方案的检测方法每检测一次果胶酶活性所需成本仅0.07元，这对果胶酶活性检测的广泛普及具有深远的意义，特别是在偏远或资源有限的地区，本方案的检测方法的成本不仅友好且非常便于操作。
[0010]2、与现有粘度测定法和比色法检测PG活性相比，本方案更加简单、方便、经济，其不需要任何复杂的仪器、训练有素的人员、繁琐的操作过程、高试剂/分析物体积消耗以及染料试剂，同时本方案提供的检测结果及最低检测浓度(定量限)更加准确。申请人实验证明，本方案所用检测方法的灵敏度(定量限为0.025U/mL或0.005单位)，显著优于现有技术使用复合聚半乳糖醛酸
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钌红色染料偶联物的纸基比色策略的灵敏度(检测限为0.02单位)。
[0011]3、与现有技术中基于纸张的比色策略(0.02
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0.10单位的线性范围)相比，本方案的检测方法的检测范围(0.005
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0.160单位的线性范围)也更加宽，使得本方案的适用范围更广泛，且检测精度更高。
[0012]4、传统用于测定PG活性的粘度测定法依赖于要昂贵的粘度计和熟练的操作员，具有较长的测定时间和较高的试剂/样品量消耗，使得检测成本非常高。为了让该测定的成本降低利于推广，专利技术人进行了多方研究，最终在对多糖(果胶)进行研究的过程中，被果胶的粘性启发，发现不同浓度果胶溶液在滤纸上具有不同的扩散距离，随后专利技术人突发奇想并通过实验验证：不同分解程度的果胶溶液与扩散距离之间确有关系！专利技术人通过继续深入研究，获得其标准曲线方程；随后申请人对不同活性果胶酶与果胶溶液反应后的溶液也进行了检测，发现其所得标准曲线方程同样可用于果胶酶活性检测中；且其定量限较低、选择性较高，甚至比现有果胶酶活性检测方法(比色法)的检测精度更高，且本方案具有更简单的检测流程和更低的检测成本。本方案克服现有果胶酶活性检测方法的偏见，利用常用的检测材料和简易的操作步骤即可实现对果胶酶活性的检测，为果胶酶活性的检测方法提供了一种新思路，打破了现有果胶酶检测步骤繁琐、成本高昂的技术壁垒，具有非常深远的应用意义。
[0013]优选的，还包括标准曲线的建立，将不同浓度果胶酶标准溶液的扩散距离与果胶酶浓度进行曲线拟合获得标准曲线。采用上述方案，通过不同浓度果胶酶标准溶液与果胶溶液进行反应，并对反应形成的溶液Ⅰ在滤纸上多次扩散的扩散结果进行记录和分析，即可快速获得平均扩散记录与果胶酶活性的标准曲线方程。
[0014]优选的，所述标准曲线的建立为将多次扩散所得的不同浓度果胶酶标准溶液的平均扩散距离与log[果胶酶浓度]进行一元一次函数拟合获得标准曲线。采用上述方案，得出平均扩散距离(D)与Log[果胶酶浓度]之间的标准曲线方程，采用这个标准曲线方程，获得平均扩散距离(D)即可计算得出果胶酶浓度值，进而根据使用的样品体积即可计算出果胶酶活性值；便于检测者通过本方案的检测方法快速检测果胶酶活性。
[0015]优选的，所述滤纸为pH指示条。采用上述方案，便于不同浓度的果胶溶液在pH指示条上扩散形成不同的扩散结果。具体为，不同溶液在pH指示条上扩散时，均会形成有颜色的扩散印迹，其更易于肉眼观察，实现对酶活本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速简便的果胶酶活性检测方法，其特征在于：包括待测样品处理阶段，该阶段包括，S1、反应：果胶酶对果胶分解反应获得溶液I；S2、扩散：溶液I在滤纸上扩散并测距获得扩散距离。2.根据权利要求1所述的一种快速简便的果胶酶活性检测方法，其特征在于：还包括标准曲线的建立，将不同浓度果胶酶标准溶液的扩散距离与果胶酶浓度进行曲线拟合获得标准曲线。3.根据权利要求2所述的一种快速简便的果胶酶活性检测方法，其特征在于：所述标准曲线的建立为将多次扩散所得的不同浓度果胶酶标准溶液的平均扩散距离与log[果胶酶浓度]进行一元一次函数拟合获得标准曲线。4.根据权利要求3所述的一种快速简便的果胶酶活性检测方法，其特征在于：所述滤纸为pH指示条。5.根据权利要求2～4任意一项所述的一种快速简便的果胶酶活性检测方法，其特征在于：还包括检测阶段，将待测样品所得扩散距离代入标准曲线，获得待测样品果胶酶浓度值。6.根据权利要求5所述的一种快速简便的果胶酶活性检测方法，其特征在于：检测阶段的S1、反应：将待测果胶酶溶液与果胶溶液混合，经...

【专利技术属性】
技术研发人员：张浩，
申请(专利权)人：重庆医药高等专科学校，
类型：发明
国别省市：