pH敏感性Fc变体制造技术

本发明专利技术涉及通过pH依赖性与FcRn结合并离解的提高半衰期的Fc变体，本发明专利技术的Fc变体作为血清半衰期最大化的变体，相比于现有的提高血清半衰期的Fc变体表现出更加优秀的pH选择性FcRn结合及离解能力。因此，可通过在体内与多种低半衰期和低维持时间的肽药物治疗剂相结合来以增加的血清半衰期发挥长时间的药效。并且，可大幅减少抗体及生物药物的给药剂量及频率，由此，不仅降低新药开发成本，而且，具有可大幅提高新药开发可能性的效果。大幅提高新药开发可能性的效果。大幅提高新药开发可能性的效果。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】pH敏感性Fc变体


[0001]本专利技术涉及通过pH依赖性与FcRn结合及分离的提高半衰期的Fc变体。

技术介绍

[0002]由于蛋白质治疗剂对疾病靶点表现出非常高的特异性及较小的副作用、毒性，因此，可通过快速代替非特异性低分子化合物治疗剂来广泛应用于临床，在用于临床的蛋白质治疗剂中，当前主要使用抗体治疗剂和融合抗体Fc区域的Fc融合蛋白治疗剂。
[0003]相比于现有的低分子药物，治疗用抗体对靶标表现出非常高的特异性，不仅具有生物毒性较低且副作用较小的优点，而且，因具有约3周的优秀血清半衰期而用作最有效癌症治疗方法中的一种。事实上，世界各地的大型制药公司和研究机构均致力于研究开发特异性结合于包括癌症发病原因子的癌细胞来有效去除的治疗用抗体。开发治疗用抗体的制药公司有罗氏、安进、强生、雅培、百时美施贵宝等，尤其，在2012年，作为罗氏的代表产品有用于抗癌治疗的赫赛汀(Herceptin)、阿瓦斯汀(Avastin)和利妥昔单抗(Rituxan)等三种治疗用抗体在全球市场中实现约195亿美元的销售额，不仅创造出丰厚的利润，而且，引领了全球抗体药物市场。已知开发英夫利西单抗(Remicade)的强生公司也因销量的增加而在全球抗体市场中快速成长，而雅培、BMS等制药公司也保留有处于开发最后阶段的多种治疗用抗体。结果，在以低分子药物占据主导权的全球制药市场中，包含对于疾病靶点具备特异性且副作用较小的治疗用抗体的生物药物正迅速代替其位置。
[0004]然而，当口服给药时，由于抗体及蛋白治疗剂通过消化器官的吸收率非常低且在消化器官内部容易变性或被蛋白水解酶容易降解而导致生物利用度非常低，因此，需通过静脉注射或皮下注射进行给药，为了实现明显的治疗效果，需要频繁接种，即使作为在血液内稳定性非常优秀的蛋白治疗剂中的一种抗体，为了实现成功治疗效果，需每2～3周给药一次高剂量的治疗用抗体(2mg～8mg/体重kg)。通过上述注射方式的频繁给药不仅导致患者感到疼痛和不适，而且，存在可导致局部及全身产生浮肿、感染等副作用的问题。为了解决上述问题，应显著改善治疗用抗体及蛋白治疗剂在血液中的半衰期。
[0005]据报告，免疫球蛋白(抗体)的生物体内半衰期由Fc对于FcRn的结合介导。免疫球蛋白的Fc片段通过非特异性细胞吸收作用被内皮细胞摄取(uptake)，随后引入于酸性内体内。在酸性pH(＜6.5)的条件下，FcRn在内体内与免疫球蛋白结合，在碱性pH(＞7.4)的条件下，FcRn在血流内释放免疫球蛋白。由此，FcRn从溶酶体退化途径回收免疫球蛋白。当血清免疫球蛋白数值降低时，可将更多FcRn分子用于免疫球蛋白结合来增加免疫球蛋白的量。相反，当血清免疫球蛋白数值上升时，可增加因FcRn饱和而退化的细胞吸收的免疫球蛋白的比例(Ghetie及Ward，Annu.Rev.Immunol.18：739
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766，2000)。即，抗体的血清半衰期和持久性很大程度上取决于抗体的Fc部位置和IgG结合配体中的一个FcRn(新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor))结合。可收集免疫白细胞或血清补体分子并去除癌细胞或感染细胞等受损细胞的抗体的Fc部位置是指Cγ2及Cγ3结合域之间的部位置，介导与新生儿(neonatal)受体FcRn的相互作用，其结合从内体(endosome)向血流(bloodstream)再次循
环细胞内移入抗体(Raghavan et al.，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181
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220；Ghetie et al.，2000，Annu Rev Immunol 18：739
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766)。在此过程中，因全长分子的巨大尺寸而与肾脏过滤(kidney filtration)的抑制有所关联，具有1周至3周范围的有利的抗体血清半衰期(antibody serum half
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life)。并且，Fc对于FcRn的结合也对抗体转运起着重要作用。因此，Fc部位通过胞内运输(intracellular trafficking)及回收机制循环抗体来在维持延长血清持久性(prolonged serum persistence)方面发挥重要作用。

技术实现思路

[0006]技术问题
[0007]本专利技术的目的在于，开发引入如下突变的抗体，即，在细胞内体(在弱酸性PH条件下)增加对于FcRn的结合力，并且，在血液(在中性PH条件下)减少对于FcRn的结合力。
[0008]技术方案
[0009]为了实现上述目的，本专利技术提供pH敏感性Fc变体。
[0010]并且，本专利技术提供包含pH敏感性Fc变体的多肽。
[0011]并且，本专利技术提供包含pH敏感性Fc变体的抗体。
[0012]并且，本专利技术提供编码pH敏感性Fc变体、多肽或抗体的核酸分子。
[0013]并且，本专利技术提供包含上述核酸分子的载体。
[0014]并且，本专利技术提供包含上述载体的宿主细胞。
[0015]并且，本专利技术提供增加生物体内半衰期的蛋白质偶联物。
[0016]专利技术的效果
[0017]本专利技术的Fc变体作为血清半衰期最大化的变体，相比于现有的提高血清半衰期的Fc变体表现出更加优秀的pH选择性FcRn结合及离解能力。因此，可通过在体内与多种低半衰期及低维持时间的肽药物治疗剂相结合来以增加的血清半衰期发挥长时间的药效。并且，可大幅减少抗体及生物药物的给药剂量及频率，由此，不仅降低新药开发成本，而且，具有可大幅提高新药开发可能性的效果。
附图说明
[0018]图1为示出通过酶联免疫吸附剂测定(ELISA)在pH6.0及pH7.4的条件下确认包含Q311M及M428L Fc变体的曲妥珠单抗与FcRn的结合力的图：
[0019]PFc29：包含Q311R及M428L Fc变体的曲妥珠单抗；以及
[0020]M：包含Q311M及M428L Fc变体的曲妥珠单抗。
[0021]图2为示出包L309位置的氨基酸变体制备示意图(饱和突变(saturation mutagenesis))及包含各个Fc变体的曲妥珠单抗的表达纯化后的SDS
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PAGE凝胶照片的图。
[0022]图3为示出通过酶联免疫吸附剂测定在pH6.0的条件下确认包含Fc变体(Q311M、M428L及309位置的氨基酸变异)的曲妥珠单抗与FcRn的结合力的图：
[0023]PFc29：包含Q311R及M428L Fc变体的包含曲妥珠单抗；
[0024]FM：包含L309F、Q311M及M428L Fc变体的曲妥珠单抗；
[0025]IM：包含L309I、Q311M及M428L Fc变体的曲妥珠单抗；
[0026]MM：包含L309M、Q311M及M428L Fc变体的曲妥珠单抗；
[0027]VM：包含L309V、Q311M及M428L Fc变体的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种Fc变体，其特征在于，包含在野生型免疫球蛋白的Fc区域选自由基于Kabat编号系统的L309Y、Q311M及Q311W组成的组中的氨基酸残基的修饰。2.根据权利要求1所述的Fc变体，其特征在于，上述Fc变体包含氨基酸残基的修饰：L309Y及M428L；L309Y及Q311M；或L309Y、Q311M及M428L。3.根据权利要求1所述的Fc变体，其特征在于，上述Fc变体包含氨基酸残基的修饰：1)L309Y及Q311M；2)L309E及Q311M；3)Q311M及M428L；4)L309E、Q311M及M428L；或5)L309Y、Q311M及M428L。4.根据权利要求1所述的Fc变体，其特征在于，上述Fc变体包含氨基酸残基的修饰：1)L309E及Q311W；2)Q311W及M428L；或3)L309E、Q311W及M428L。5.根据权利要求1所述的Fc变体，其特征在于，免疫球蛋白选自由IgA、IgM、IgE、IgD及IgG组成的组中。6.根据权利要求1所述的Fc变体，其特征在于，在pH7.0至pH7.8的条件下，相比于野生型免疫球蛋白Fc区域，对FcRn表现出低结合亲和力。7.根据权利要求1所述的Fc变体，其特征在于，在pH5.6至pH6.5的条件下，相比于野生型免疫球蛋白Fc区域，对FcRn表现出高结合亲和力。8.一种多肽，其特征在于，包含权利要求1所述的Fc变体。9.根据权利要求8所述的多肽，其特征在于，相比于野生型，具有增加的生物体内半衰期。10.一种抗体，其特征在于，包含权利要求1所述的Fc变体。11.根据权利要求10所述的抗体，其特征在于，相比于野生型，具有增加的生物体内半衰期。12.一种核酸分子，其特征在于，对权利要求1所述的Fc变体、权利要求8所述的多...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑相泽，高翔焕，曹美京，
申请(专利权)人：高丽大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：