改性寡核苷酸及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种改性寡核苷酸及其合成方法，所述改性寡核苷酸含有在磷原子上被取代的一种或多种磷酸酯基团。的一种或多种磷酸酯基团。的一种或多种磷酸酯基团。

【技术实现步骤摘要】
改性寡核苷酸及其制备方法
[0001]本申请是2014年8月28日提交的PCT国际申请PCT/RU2014/000647于2017年2月17日进入中国国家阶段的申请号为201480081300.5、专利技术名称为“改性寡核苷酸及其制备方法”的中国专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及具有改性磷酸基团的核苷酸和寡核苷酸，以及它们的制造方法。

技术介绍

[0003]核酸衍生物，例如附加有各种额外功能的寡核苷酸在生命科学中被广泛用作研究工具，具体而言，它们被认为是有前景的疗法[1]和用于分子诊断的灵敏探针[2]。一些寡核苷酸疗法已经受到FDA批准用于临床。实例包括抗病毒试剂福米韦生(Fomivirsen,ISIS 2922)[3]、抗血管生成适体哌加他尼钠(Pegaptanib sodium)[4]和抗胆固醇缺口聚物(gapmer)米泊美生(Mipomersen)(Kynamro,ISIS 301012)[5]。一些其它寡核苷酸候选物，如siRNA、DNA酶和反吗啉类似物(PMO)目前正处于临床试验的各个阶段。
[0004]若要被认为是潜在疗法，则寡核苷酸应当满足以下要求。
[0005]1.与它们的生物标靶(通常为细胞RNA)的互补配合物具有足够的稳定性和序列特异性。
[0006]2.在生物介质如血清中提高的抗性。
[0007]3.有利的物理化学性质，如水溶解性和化学稳定性。
[0008]4.经济有效的合成和可接受的价格。
[0009]5.优选在不使用外传染剂的情况下具有充分的细胞摄取和体内递送。
[0010]根据作用机制，寡核苷酸类似物实际上可以干预遗传信息传递的任何阶段：从DNA到RNA(转录)或从RNA到蛋白质(转译)。通过用三链体形式的寡核苷酸(TFOs)[6]特别是肽核酸(PNAs)[7]结合基因组DNA来进行转录的抑制。转译的抑制(反义机制)通过mRNA阻断来实现[8]。迄今已知的大多数寡核苷酸类似物通过反义机制起作用。那些是小的干预RNA(siRNA)[9],核酸酶(核酶或脱氧核酶)[10]，以及大部分化学改性寡核苷酸类似物[11]。特定的寡核苷酸衍生物如适体也能够通过直接与蛋白质或小分子辅因子结合来阻断蛋白质功能[12]。
[0011]大部分反义寡核苷酸类似物结合mRNA并通过立体阻挡来抑制转译[13]。它们包括在糖部分具有修饰的大部分类似物，例如2
’‑
氟[14],2
’‑
O
‑
甲基[15],2
’‑
O
‑
β
‑
甲氧基乙基(2
’‑
MOE)[16]或锁核酸(LNA)[17]衍生物。用不带电基团取代阴离子性核苷间磷酸酯基团如甲基膦酸酯[18]、磷酸三酯[19]或氨基磷酸酯[20]的寡核苷酸类似物也通过立体阻挡来起作用。远端和酸模拟物如PNA[21]或磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)[22]的作用中也涉及相同的反义机制。
[0012]其它兴趣也关注这些类似物，其能够通过催化RNA发生水解来不可逆地使RNA失活，例如通过用2
’‑
脱氧硫代磷酸酯[23],аrа
‑2’‑
氟衍生物(2
’‑
FANA)[24]或缺口聚物[24]来吸附细胞酶RNase H。SiRNA通过激活具有核糖核酸活性的RISC复合物来诱导mRNA的催化裂解[25]，其中核酸酶(核酶或脱氧核酶)不需要针对它们催化RNA裂解作用的蛋白质[27]。
[0013]许多寡核苷酸类似物已经修饰了核苷间磷酸酯基团。它们中有硫代磷酸酯[28]、二硫代磷酸酯[29]和borano磷酸酯[30]。这些衍生物的一个正面特点是它们相对低的成本，因为使用天然2
’‑
脱氧核糖核苷酸和高效固态DNA磷酸酰二胺化学[31]。磷酸酯改性的类似物包含不对称磷原子并且通常以n聚体寡核苷酸的2
n
‑1种非对映异构体的混合物的形式获得。不同的非对映异构体通常具有不同的RNA亲和性和酶耐性，这对于潜在的反义作用是至关重要的。
[0014]目前，特别优先的任务是开发具有充分细胞摄取和体内递送的寡核苷酸类似物，优选不存在外部递送试剂如阳离子脂质体、聚合物或纳米颗粒。这里，具有降低或完全消除负电荷的寡核苷酸类似物可能特别受关注[32]。其中有用电中性氨基磷酸酯基取代阴离子磷酸酯的寡核苷磷酸酯。氨基磷酸酯的化学合成相对简单。但是，这些类似物显示出降低的RNA亲和性[33]并且对酸性水解敏感[34]。N3
’→
P5
’
氨基磷酸酯已经提高了RNA结合，但是难以合成[35]。那些在侧链具有正电基团的代表更加容易靠近并且具有优异的酶活性，但是它们的RNA亲和性较低[36]。与此同时，大部分已知的氨基磷酸酯衍生物包含有用的反义试剂如吗啉(PMOs)[37]在酸性pH下显示出某种程度的不稳定性。需要提高酸稳定性来防止寡核苷酸类似物在内体内部降解。
[0015]在过去二十年中，已经出现了新型膦酸酯寡核苷酸类似物，其用可离子化的膦酸酯基取代天然磷酸酯。它们中有膦酰基乙酸酯和硫代膦酰基乙酸酯[38]、膦酰基甲酸酯[39]和1,2,3
‑
三唑
‑4‑
基膦酸酯[40]。这些化合物显示出提高的生物抗性和适当的RNA结合，并且,它们支持RNase H裂解并且即使没有转染试剂也具有提高的细胞摄取。但是，它们的化学合成困难且昂贵。
[0016]还报道了至少曾经含有P＝N
‑
Acc结构的改性核苷酸和寡核苷酸,其中Acc为电子受体[41]。合适的Acc的例子有
–
CN、
‑
SO2R和缺电子的六元N
+
杂环，在所述杂环中至少一个氮是烷基化的并且在邻位或对位。
[0017]目前，磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸(PMO)受到很多关注，其是已知的反义试剂[42]。它们可以从GeneTools LLC公司购得。人们积极地探索PMO作为Sarepta疗法的潜在治疗药物(2012AVI Biopharma)。在2013年，该公司宣布成功完成了PMO药物Eteplirsen(AVI
‑
4658)治疗杜氏肌营养不良(DMD)的阶段III临床试验，该临床试验修正了抗肌萎缩蛋白前体mRNA的异常剪接[43]。在2014年初Sarepta Therapeutics声称他们的吗啉代候选药物AVI
‑
7288已经成功通过了针对含RNA的病毒引起的致命的马尔堡出血热的阶段I临床试验[44]。
[0018]然而，吗啉与其它氨基磷酸酯一样是酸敏感性的[45]。此外，它们的合成建立在P(V)化学反应的基础上[46]。该化学反应可能导致副反应，例如鸟嘌呤中发生O6的改性[47]。该副反应可以通过O6位上的保护基团来防止[48]，但是这需要特殊的G单体，这增加了PMO合成的成本。该化学本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种式(I)的化合物，其中Z选自
‑
O
‑
、
‑
S
‑
、
‑
Se
‑
、
‑
N
‑
RN或
‑
BH3‑
，其中R
N
为H、C1‑4烷基或保护基团；X选自核苷、核苷类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物的5
’
端，且Y选自核苷、核苷类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物的3
’
端；
‑
H、
‑
OH、
‑
SH、NHR
N
、
‑
O
‑
PG、S
‑
PG，其中PG是保护基团；连接基、单磷酸酯或二磷酸酯或标记或淬灭剂；或者Y选自核苷、核苷类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物的3
’
端，且X选自5
’
端核苷、核苷类似物、寡核苷酸或寡核苷酸类似物、
‑
H、
‑
OH、
‑
SH、NHR
N
、
‑
O
‑
PG或S
‑
PG，其中PG是保护基团；连接基、单磷酸酯或二磷酸酯或标记或淬灭剂；R1选自
‑
NR
1A
R
1B
、
‑
OR3、
‑
SR3、
‑
H、
‑
S(O)H、
‑
S(O)R3、
‑
S(O)2H、
‑
S(O)2R3、
‑
S(O)2NH2、
‑
S(O)2NHR3、
‑
S(O)2NR
32
、
‑
C1‑
10
烷基、
‑
C2‑
10
烯基、
‑
C2‑
10
炔基、
‑
C6‑
10
芳基或
‑
C5‑
10
杂芳基；R2选自
‑
H、
‑
NR
2A
R
2B
、
‑
OR3、
‑
SR3、卤素、
‑
CN、
‑
S(O)H、
‑
S(O)R3、
‑
S(O)2H、
‑
S(O)2R3、
‑
S(O)2NH2、
‑
S(O)2NHR3、
‑
S(O)2NR
32
,
‑
C1‑
10
烷基,C2‑
10
烯基,C2‑
10
炔基,
‑
C6‑
10
芳基或
‑
C5‑
10
杂芳基；其中每个R
1A
、R
1B
、R
2A
和R
2B
独立地选自
‑
H、
‑
C1‑
10
烷基、C2‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：德米特里，
申请(专利权)人：努根有限责任公司，
类型：发明
国别省市：