一种pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6siRNA纳米片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6siRNA纳米片及其制备方法和应用，所属纳米片包含超薄水滑石，Nr2f6siRNA和pH敏感物(聚乙二醇修饰二甲基马来酸酐，PEG

【技术实现步骤摘要】
一种pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6 siRNA纳米片及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属纳米给药系统的制备，具体涉一种pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6siRNA纳米片及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肝细胞肝癌(HCC)是全球范围内第六大高发癌症和第四大癌症相关死亡原因，每年约有841,000例新病例和782,000例死亡病例。2018年我国癌症数据统计显示，36.4％的癌症相关死亡的百分比来自消化道癌症(胃癌,HCC和食管癌)，其中HCC作为中国第四大常见癌症，严重威胁人民的生命和健康。尽管我们对HCC实施了广泛的监测计划，但仍有超过一半的HCC患者在确诊时就已为晚期，并丧失了进行根治性手术切除的机会。同时，不论就诊时患者处于哪个阶段或者接受了以上几种联合治疗，肿瘤复发和治疗后再发新癌灶仍是目前存在的主要问题。之前的研究表明，尽管患者在早期HCC阶段接受了根治性切除或消融治疗，但由于肿瘤微环境(TME)等因素对肿瘤生物学行为的影响，高达70％的HCC患者5年内复发。通过单一纳米载体同时影响肿瘤微环境和癌细胞，递送siRNA,是一种新的治疗方案。
[0003]层状双氢氧化物(LDHs)，作为一种具有较好生物相容性和可生物降解的2D纳米材料，是构建多功能纳米平台的理想选择。LDHs通式[[M
2+1
‑
x
M
3+x
(OH)2]x+
(A
n
‑
)
x/n
·
mH2O,,M代表形成氢氧化物层的二价和三价金属离子，如钴(Co)等，An
‑
表示层间相互作用的可交换阴离子。这一独特结构，使得各种功能性金属阳离子能够被掺进用于影像成像、药物递送、基因保护等。同时，金属离子的OH基团的配位使LDH对弱酸性溶液敏感，在酸性环境中易生物降解释放出与生物相容性阳离子和H2O，最大限度地减少试剂长期体内蓄积风险，并促进药物释放，增强治疗效果。
[0004]带正电荷的LDH显示出对癌细胞膜的高亲和力的同时，容易在生理环境中与血清成分产生非特异性相互作用，并被网状内皮系统快速清除。聚乙二醇(PEG)化可在空间上稳定纳米颗粒，从而减少体内的非特异性相互作用，延长循环时间，并通过增强高渗透长滞留效应促进了纳米粒在肿瘤的蓄积。然而，PEG化会强烈抑制细胞摄取，导致递送活性的显着损失。常见的酰胺键一般是不可降解的，或者仅在极端的pH值下才能降解，但是马来酸酰胺(DMMA)衍生物的酰胺键可在弱酸性pH值下断裂。利用DMMA在肿瘤微酸环境中电荷逆转，使静电吸附在LDH上的PEG在酸性环境中脱离，来改善体内siRNA的传递，是一个可行的策略。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，本专利技术提供了一种pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6 siRNA纳米片及其制备方法和应用。本专利技术将Cu
2+
掺入CoFe
‑
LDHs,形成单层三元CoCuFe
‑
LDHs(CCF)作为纳米核静电吸附siRNA，用PEG
‑
DMMA做壳，增加LDH在体内循环时间并响应肿瘤微酸环境进行核
‑
壳分离，高效递送基因到肝癌细胞和免疫细胞。
[0006]本专利技术的第一个目的在于提供一种pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6 siRNA纳米片的
制备方法，其包括如下步骤：
[0007]1)将Cu(II)盐，Co(II)盐和Fe(III)盐溶于DEPC水中，形成均匀溶液A；将NaNO3溶于含甲酰胺的DEPC水中形成溶液B；将NaOH溶于DEPC水中形成溶液C；
[0008]2)溶液A和溶液C缓慢地添加到溶液B中，搅拌，离心，然后进一步透析以除去甲酰胺，得到超薄铜钴铁水滑石胶体溶液；
[0009]3)将超薄铜钴铁水滑石胶体溶液与Nr2f6 siRNA进行吸附，得到负载siRNA超薄铜钴铁水滑石胶体溶液；
[0010]4)在pH 8.5的PBS中，溶解NH2–
PEG，将DMMA缓慢加入溶液中；在室温下反应，反应结束后，在水中透析，再冷冻干燥，得到PEG
‑
DMMA；
[0011]5)将步骤4)得到的PEG
‑
DMMA和步骤3)得到的负载siRNA超薄铜钴铁水滑石胶体溶液混合吸附，得到pH响应超薄铜钴铁水滑石复合Nr2f6 siRNA纳米片。
[0012]根据本专利技术的优选方案，步骤1)的溶液A中，Cu和Co的总和与Fe的摩尔比为2
‑
4：1，最优选为2：1；Cu与Co的摩尔比为0.2
‑
0.5：1，最优选为0.25：1。所述的Cu盐、Co盐和Fe盐均为硝酸盐或其水合物。
[0013]根据本专利技术的优选方案，步骤5)中，PEG
‑
DMMA与负载siRNA超薄铜钴铁水滑石胶体溶液中溶质的质量比为3
‑
5：1，最优选为4：1。
[0014]根据本专利技术的优选方案，Nr2f6 siRNA正义链的碱基序列如SEQ ID No.1所示，反义链的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
[0015]根据本专利技术的优选方案，步骤3)中，超薄铜钴铁水滑石胶体溶液和Nr2f6 siRNA的质量比为40
‑
120：1，最优选为100：1。
[0016]根据本专利技术的优选方案，所述的Cu盐、Co盐和Fe盐均为硝酸盐或其水合物；B溶液中甲酰胺含量为20
‑
30％，溶液C中NaOH与溶液A中的金属盐溶液中的总金属离子摩尔比为6
‑
7：1。步骤2)中，溶液A、溶液B、溶液C的体积用量比为1:1：(1
‑
1.5)。
[0017]根据本专利技术的优选方案，反应过程需要全程通氮气保护。
[0018]根据本专利技术的优选方案，步骤2)中，透析截留分子量3kDa；步骤4)中透析截留分子量8kDa。
[0019]本专利技术的第二个目的在于提供一种pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6 siRNA纳米片，其是由超薄铜钴铁水滑石负载siRNA,包被pH敏感物(PEG
‑
DMMA)构成的纳米载药体系，得到水滑石通过对肿瘤微环境的pH响应同时传递siRNA至免疫细胞和癌细胞，双重调节改善肝癌抑制性免疫微环境，对肝癌细胞具有显著的抑制作用。该纳米具有较低的背景毒性，且具有光热效应，在双模态MRI成像指导下实现对肝癌靶向成像及干预的一体化，维持对肝癌的免疫控制，降低肝癌复发和转移。
[0020]本专利技术的第三个目的是提供一种pH敏感超薄水滑石联合Nr2f6 siRNA纳米片在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。本专利技术基于LDH,构建具有pH响应性褪去“PEG外壳”纳米片，该功能纳米片具有光热效能，能高效传递siRNA至肝癌细胞及免疫细胞，协同温和PTT强烈刺激全身抗肿瘤免疫反应，在双模态MRI指导下实现对HC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种pH响应超薄铜钴铁水滑石复合Nr2f6 siRNA纳米片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将Cu(II)盐，Co(II)盐和Fe(III)盐溶于DEPC水中，形成均匀溶液A；将NaNO3溶于含甲酰胺的DEPC水中形成溶液B；将NaOH溶于DEPC水中形成溶液C；2)溶液A和溶液C缓慢地添加到溶液B中，搅拌，离心，然后进一步透析以除去甲酰胺，得到超薄铜钴铁水滑石胶体溶液；3)将超薄铜钴铁水滑石胶体溶液与Nr2f6 siRNA进行吸附，得到负载siRNA超薄铜钴铁水滑石胶体溶液；4)在pH 8.5的PBS中，溶解NH2–
PEG，将DMMA缓慢加入溶液中；在室温下反应，反应结束后，在水中透析，再冷冻干燥，得到PEG
‑
DMMA；5)将步骤4)得到的PEG
‑
DMMA和步骤3)得到的负载siRNA超薄铜钴铁水滑石胶体溶液混合吸附，得到pH响应超薄铜钴铁水滑石复合Nr2f6 siRNA纳米片。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)的溶液A中，Cu和Co的总和与Fe的摩尔比为2
‑
4：1；Cu与Co的摩尔比为0.2
‑
0.5：1。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤5)中，PEG
‑
DMMA与负载siRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：余日胜，卢园飞，杜永忠，周佳萍，周巧妹，杨晓艳，余洁倪，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：