一种鉴定烟草腺毛密度的DNA分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记及其应用，该鉴定烟草腺毛密度的分子标记的引物包括：上游引物W12

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定烟草腺毛密度的DNA分子标记及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别涉及一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记及其应用。

技术介绍

[0002]烟草是我国重要的经济作物，烟草表面密布表皮毛，根据表皮毛形态特征及是否具有分泌能力，可分为三种类型：长柄腺毛、短柄腺毛和非分泌型表皮毛。
[0003]烟草腺毛具有旺盛的分泌能力，能够合成并分泌多种次生代谢产物，在烟株应对环境胁迫中发挥着重要作用。腺毛分泌物可以在烟株表面形成一层连续而黏稠的膜状物，阻碍昆虫移动，导致其饥饿、窒息死亡。此外腺毛分泌物中的二萜类物质及蔗糖酯对蚜虫都有毒杀作用；在应对病原微生物方面，烟草短柄腺毛分泌的抗性蛋白Phylloplanins可以抑制烟草霜霉菌(Peronospora tabacina)孢子囊和分生孢子的萌发，从而保护烟草免受其侵袭。
[0004]烤后烟叶香气品质是烤烟最重要的性状，腺毛分泌物对烟叶品质也具有重要影响。烤烟腺毛分泌物主要为类西柏烷二萜化合物和蔗糖脂，二者都是重要的致香前体物质。类西柏烷化合物主要由α和β
‑
型西柏三烯一醇(CBT
‑
ol)和西柏三烯二醇(CBT
‑
diol)及其同分异构体组成，该类物质调制后大部分降解，主要产物是茄酮及其衍生物，茄酮本身具有很好的香气，而其转化产物如茄醇、茄尼呋喃、降茄二酮等也是重要的香味物质。蔗糖酯与烟草吸味的丰满度相关，在卷烟的燃吸过程中，蔗糖酯通过热解产生低分子挥发性的酸和酯，如异丁酸，3
‑
甲基丁酸和3
‑
甲基戊酸等，可赋予卷烟香料烟烟气特有的香气；此外，糖酯还具有保湿、保润、保香等作用。
[0005]综述所述，提高烟草腺毛密度将有效增强烟株对环境胁迫的抗性，并提高烟叶的香气品质，因此提高腺毛密度是烟草育种的重要目标之一。然而，由于烟草腺毛密度受到栽培手段、生态条件等诸多环境因素的影响，加之腺毛形态较小，需要显微观察才能进行有效筛选，因此极大限制了采用常规育种手段进行烟草腺毛性状的改良。现代生物技术的发展为烟草腺毛表型鉴定提供了一种快速有效的方法——DNA分子标记，通过开发与腺毛密度紧密连锁的分子标记，只需要少量的基因组DNA即可实现对腺毛密度的精准选择。由于烟株任何组织都具有相同的基因组成，因此只可以在烟株发育任何时期采集极少量的组织即可完成鉴定，避免了对待选单株的破坏性取样，并能实现早期筛选。
[0006]本研究团队前期在烟草EMS诱变群体中发现了一株腺毛密度显著提高的突变体，进一步研究发现该突变体基因组发生了一段7碱基的缺失，是造成该单株出现多腺毛表型的原因。因此该突变体可以作为高腺毛密度的供体亲本，通过针对该7碱基缺失突变开发分子标记，可以有效提高筛选效率，对烟草高腺毛育种具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0007]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记及其应用，
其可以有效提高筛选效率，对烟草高腺毛育种具有重要的应用价值。
[0008]本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0009]一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记的引物，所述引物包括以下上游引物和下游引物：
[0010]上游引物W12
‑
seq
‑
F：5
’‑
GACAGGGGAGATTATTCAAAA
‑3’
；
[0011]上游引物W12
‑
WT
‑
F：5
’‑
CACCACGAGTGATCAACCACC
‑3’
；
[0012]公共下游引物W12
‑
R：5
’‑
TTGAAAAACAGGGCTAGAGGG
‑3’
。
[0013]一种包含上述的鉴定烟草腺毛密度的分子标记的引物的试剂盒。
[0014]一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记的方法，包括以下步骤：
[0015](1)引物合成：合成引物W12
‑
seq
‑
F、W12
‑
WT
‑
F以及W12
‑
R；
[0016](2)DNA的提取：提取烟草叶片的基因组DNA；
[0017](3)PCR扩增：基于上述烟草叶片基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物进行PCR扩增，引物组合分别为W12
‑
seq
‑
F+W12
‑
R和W12
‑
WT
‑
F+W12
‑
R，预先加入两个已经确定为高腺毛密度和低腺毛密度且基因序列已知的样本DNA作为对照；
[0018](4)扩增产物检测与分析：
[0019]直接测序：对于W12
‑
seq
‑
F+W12
‑
R引物组合扩增的产物，直接进行测序，若所测DNA片段135
‑
141bp位置的7
‑
bp缺失，即与SEQ ID NO.4序列相同，则为高腺毛密度单株；若所测DNA片段135
‑
141bp位置的没有缺失，即与SEQ ID NO.5序列相同，则为低腺毛密度单株；若测序峰图为套峰，为低腺毛密度单株；
[0020]琼脂糖凝胶检测：对于W12
‑
WT
‑
F+W12
‑
R引物组合的扩增产物进行琼脂糖凝胶检测，若W12
‑
WT
‑
F+W12
‑
R引物组合不能扩增出条带，则为高腺毛密度单株；若W12
‑
WT
‑
F+W12
‑
R引物组合能扩增出条带，则为低腺毛密度单株。
[0021]优选地，上述技术方案中，步骤(3)中PCR扩增反应体系为：50ng/μL的样品基因组DNA模板1.0μL，2
×
EASY Taq mix 10μL，10μM的上下游引物各0.4μL，ddH2O补足至20μL。
[0022]优选地，上述技术方案中，步骤(3)中PCR扩增程序为：95℃预变性5min，然后95℃ 30s，57℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环，最后72℃10min。
[0023]一种所述的引物、所述试剂盒或所述的方法在烟草育种中的应用。
[0024]一种所述的引物、所述试剂盒或所述的方法在筛选烟草不同腺毛密度单株中的应用。
[0025]本专利技术上述技术方案，具有如下有益效果：
[0026](1)本专利技术提供的分子标记引物，可以较为精确的鉴定待测烟株的腺毛密度，从而省去了烟株叶面腺毛观察，大幅减少了表型鉴定的工作量；
[0027](2)本专利技术提供的分子标记引物，可以在烟株发育早期进行鉴定，只对中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记的引物，其特征在于，所述引物包括以下上游引物和下游引物：上游引物W12
‑
seq
‑
F：5
’‑
GACAGGGGAGATTATTCAAAA
‑3’
；上游引物W12
‑
WT
‑
F：5
’‑
CACCACGAGTGATCAACCACC
‑3’
；公共下游引物W12
‑
R：5
’‑
TTGAAAAACAGGGCTAGAGGG
‑3’
。2.一种包含权利要求1所述的鉴定烟草腺毛密度的分子标记的引物的试剂盒。3.一种鉴定烟草腺毛密度的分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)引物组合成：合成如权利要求书1所述的引物W12
‑
seq
‑
F、W12
‑
WT
‑
F以及W12
‑
R；(2)DNA的提取：提取烟草叶片的基因组DNA；(3)PCR扩增：基于上述烟草叶片基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物进行PCR扩增，引物组合分别为W12
‑
seq
‑
F+W12
‑
R和W12
‑
WT
‑
F+W12
‑
R，预先加入两个已经确定为高腺毛密度和低腺毛密度且基因序列已知的样本DNA作为对照；(4)扩增产物检测与分析：直接测序：对于W12
‑
seq
‑
F+W12
‑
R引物组合扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：田涛，杨永锋，马一琼，王召军，刘茂林，芦昶彤，杨欣玲，
申请(专利权)人：河南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：