一种微波衍生-拟靶标气相色谱-质谱分析土壤中代谢物的方法技术

本发明专利技术公开了一种微波衍生

【技术实现步骤摘要】
一种微波衍生
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拟靶标气相色谱
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质谱分析土壤中代谢物的方法


[0001]本专利技术涉及一种微波衍生
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拟靶标气相色谱
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质谱分析土壤中代谢物的方法，属于土壤微生物代谢组学研究的定性与定量分析方法领域。

技术介绍

[0002]代谢组学是对生物或细胞在特定生理时期内全部低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析，以样本中主要代谢物为变量，通过高通量的检测和数据处理手段，对数据信息进行建模与预测，研究土壤在外界环境发生变化后其代谢产物的变化规律。土壤代谢组学具有极大的应用前景，主要表现为：1、土壤微生物群落代谢组图谱提供了一种潜在的表征土壤及评估土壤生物群落代谢状态的方法；2、土壤代谢组学指纹图谱与土壤养分评价指标密切有关，如包括pH、土地利用、水分和盐度等指标；3、土壤代谢组学能够区分土壤类别及可作为土壤质量评价指标的潜在能力；4、土壤代谢组学为揭示土壤微生物群落中复杂的分子网络和代谢途径以及评价土壤功能提供了一定依据；5、土壤代谢组学能够揭示化感代谢物对微生物群落结构及功能的影响。
[0003]代谢组学技术能够识别相互作用代谢途径中的生化中间产物，潜在地提高了对土壤中生物过程的整体理解，并提高预测结果的能力。将代谢组学应用于土壤微生物组，可以提供一种表征微生物群落差异活动的方法，反映微生物基因组与环境的相互作用，从而提供一种评估土壤健康的新方法。这有利于对细胞途径及非生物和生物胁迫下群落的反应进行理解，也可以对土壤基本生化功能提出新的见解。结合互补的“组学”技术(基因组学、蛋白质组学、转录组学)，代谢图谱可以更全面地理解与环境线索相关的分子机制，更容易地区分代谢物诱导的酶抑制和基因组或蛋白质组调节，同时也有可能提供对土壤微生物分子途径及其与环境关联性的深入和整体的理解。
[0004]气相色谱
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质谱能够覆盖绝大多数的初级代谢物与部分次生代谢物，标准谱库的物质鉴定结合其高分离能力，已成为代谢组学研究中重要的分析工具。但由于土壤的高复杂性和异质性，使其具有独特的物理和化学性质，如强吸附性和高含量的有机质、金属离子等，可能会影响到代谢物的提取效率和衍生反应效率。例如，氨基(如胺和氨基酸)对硅烷化反应的反应性低，不完全或部分衍生化往往导致单一分析物出现多个峰、峰重叠、峰小或缺失，从而导致定性与定量不准确。土壤基质中的代谢物丰度远低于植物，现已鉴定的代谢物类型和数量也有限，一般少于100种代谢物，无法全面地体现土壤代谢产物的差异情况。此外，在常规加热衍生化反应条件下，衍生化时间通常需要2
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3h。因此，有必要开发一种提高特异性、通量、覆盖率的代谢组学分析方法，以适应土壤基质的特殊性。

技术实现思路

[0005]基于上述，本专利技术提供一种微波衍生
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拟靶标气相色谱
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质谱分析土壤中代谢物的方法，目的是设计一种高特异性、通量、覆盖率的代谢组学分析方法，方法可以全面、综合地
体现土壤代谢产物的差异情况，为研究土壤代谢组学提供一种速度快、高稳定性、高灵敏度、宽线性、高覆盖性的分析方法，以克服现有技术的不足。
[0006]本专利技术的技术方案是：一种微波衍生
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拟靶标气相色谱
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质谱分析土壤中代谢物的方法，包括：
[0007]S1土壤样品提取：将内标物质与提取溶剂加入到土壤样品中，混匀，涡旋提取，离心过滤得土壤提取溶液；
[0008]S2土壤提取溶液低温干燥：将土壤提取溶液在0
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8℃条件下离心浓缩，得到冻干提取物；采用低温冷冻干燥能最大程度降低微生物活性，减少代谢物降解。
[0009]S3土壤冻干提取物溶解：向冻干提取物中加入转移溶剂，涡旋溶解，离心，转移上层清液于色谱瓶中，常温条件下氮气流下干燥，再加二氯甲烷干燥，得到完全干燥的土壤提取物；对代谢物再次溶解与干燥处理能最大程度减少结晶水的衍生化的影响，也能减少有机质及金属离对硅烷化的基质效应。
[0010]S4土壤代谢物衍生化：向完全干燥的土壤提取物中加入衍生化试剂，涡旋混匀，在微波反应条件下进行肟化和硅烷衍生化，得土壤代谢衍生化产物；采用肟化和硅烷2步衍生化能有效保护羰基，减少糖类代谢物定量的多重异构体峰，减少色谱峰的复杂性，且使得衍生化产物具有较高的挥发性进行气相色谱
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质谱分析。
[0011]S5土壤代谢物衍生化产物的转移：向土壤代谢衍生化产物中加入正十二烷吡啶溶液，涡旋混匀，离心后取上层清液于微量色谱瓶中；
[0012]S6土壤代谢衍生化产物的测定：采用拟靶标气相色谱
‑
质谱的方式对土壤代谢衍生化产物进行分离、定性与定量，以保留时间、保留指数、标准品及质谱数据库比对进行定性，内标法定量。
[0013]可选的，在土壤样品提取中，内标物质为邻甲氧基苯酚
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D3、L
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(+)
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正缬氨酸、己二酸、阿东糖醇、棕榈酸
‑
D
31
和苯基
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β
‑
D
‑
吡喃葡萄糖苷水合物。
[0014]可选的，在土壤样品提取中，采用甲醇：水(v:v＝3:2)与水作为提取溶剂进行序列提取，甲醇：水提取2次，水提取1次。
[0015]可选的，在土壤冻干提取物溶解中，转移溶剂为甲醇溶液，转移进行衍生化的容器为螺旋颈回收瓶。
[0016]可选的，在土壤代谢物衍生化中，衍生化试剂先加入甲氧胺盐酸盐吡啶溶液肟化反应，再加入BSTFA+1％TMCS硅烷化反应，体积比为1:5
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1:6(甲氧胺盐酸盐吡啶溶液与BSTFA+1％TMCS v/v)。
[0017]可选的，在土壤代谢物衍生化反应中，微波能量为800w，肟化微波加热反应分别3+2min；硅烷化衍生微波加热反应分别3+3+3min。
[0018]可选的，气相色谱
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质谱分析的条件为：拟靶标气相色谱
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质谱的方式采集数据进行定量；色谱柱：HP
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5MS(60m
×
250μm
×
0.25μm)毛细管色谱柱，进样口温度：280℃；进样量：1.00uL；分流比：8:1；柱流速：1.0mL/min；升温程序：60℃保持2min，然后以5℃/min升到230℃保持5min，8℃/min升到290℃保持25.5min，一共运行74min；质谱条件：离子源温度：230℃，四级杆温度：150℃；电离能：70eV，传输线温度：280℃，全扫描质量数范围45
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600aum，溶剂延迟：11.90min；采集模式：全扫描(Scan)采集；MS谱库：NIST14库和Willy08库，对定性的物质进行拟靶标代谢组学方法进行选择离子扫描定量。
[0019]本专利技术的有益效果是：专利技术了一种土壤中代谢物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微波衍生
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拟靶标气相色谱
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质谱分析土壤中代谢物的方法，其特征在于，包括：S1土壤样品提取：将内标物质与提取溶剂加入到土壤样品中，混匀，涡旋提取，离心过滤得土壤提取溶液；S2土壤提取溶液低温干燥：将土壤提取溶液在0
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8℃条件下离心浓缩，得到冻干提取物；S3土壤冻干提取物溶解：向冻干提取物中加入转移溶剂，涡旋溶解，离心，转移上层清液于色谱瓶中，常温条件下氮气流下干燥，再加二氯甲烷干燥，得到完全干燥的土壤提取物；S4土壤代谢物衍生化：向完全干燥的土壤提取物中加入衍生化试剂，涡旋混匀，在微波加热条件下进行肟化和硅烷衍生化反应，得土壤代谢物衍生化产物；S5土壤代谢物衍生化产物的转移：向土壤代谢物衍生化产物中加入正十二烷吡啶溶液，涡旋混匀，离心后取上层清液于微量色谱瓶中；S6土壤代谢衍生化产物的测定：采用拟靶标气相色谱
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质谱的方式对土壤代谢物衍生化产物进行分离、定性与定量，以保留时间、保留指数、标准品及质谱数据库比对进行定性，内标法定量。2.根据权利要求1所述的分析土壤中代谢物的方法，其特征在于，在土壤样品提取中，内标物质为邻甲氧基苯酚
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D3、L
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(+)
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正缬氨酸、己二酸、阿东糖醇、棕榈酸
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D
31
和苯基
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β
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D
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吡喃葡萄糖苷水合物。3.根据权利要求1所述的分析土壤中代谢物的方法，其特征在于，在土壤样品提取中，采用甲醇：水(v:v＝3:2)与水作为提取溶剂进行序列提取，甲醇：水...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡凯，高维常，高川川，林叶春，赵瑞娟，许冬青，潘文杰，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：