基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法、稀土基近红外纳米材料体系及其应用技术

本发明专利技术公开一种基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法、稀土基近红外纳米材料体系及其应用，解决现有光遗传领域中的有创、低效率、单一化以及高成本等问题。针对不同类型的光敏蛋白设计合成与之匹配的稀土基近红外纳米材料作为其中继激发光源。将两种不同的光敏蛋白分别表达目标神经细胞膜上，将两种与其响应波段相匹配的近红外中继纳米材料转至对应的目标神经细胞区域。使用不同通道近红外光源对目标区域进行刺激，目标区域的两种中继材料可分别将不同通道的近红外激发光源转换成为可被目标光敏蛋白接收响应的可见光，使光敏通道蛋白被激活从而实现利用不同光源对相同种神经细胞或同一光源对不同种神经细胞的兴奋或抑制的独立控制。的兴奋或抑制的独立控制。的兴奋或抑制的独立控制。

【技术实现步骤摘要】
基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法、稀土基近红外纳米材料体系及其应用


[0001]本专利技术属于光遗传学
，具体涉及一种基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法稀土基近红外纳米材料体系及其应用。

技术介绍

[0002]记录和操控神经元的活性是神经科学和脑科学机制研究的最基本手段。光遗传学技术是一项先进的，高时空特异性的应用基因工程技术。这项技术将光控技术与遗传学技术相结合，结合了光敏蛋白的特性。通过遗传学方法使得光敏蛋白的基因在某一种特定的细胞内特异性地表达，再通过光控技术，使用与所表达的光敏蛋白相关的一定波长的光，给予相应的光照刺激，因为光敏蛋白的特异性变化，从而改变细胞的活动状态。新兴的光遗传学技术最先广泛应用于神经科学，多用于脑环路功能与行为学的关系、抑郁症的治疗、癫痫以及帕金森综合征治疗研究。
[0003]在2006年，斯坦福的博士Karl Deisseroth在自己的研究中首次提到了光遗传学(Optogenetics)，因其具有的高度的时空分辨率，短短的十多年，神经科学的研究已经取得了许多重大的突破，神经科学的研究得到了飞速的发展。它结合光敏感的通道蛋白的特性与神经元的兴奋抑制与膜内外电位的密切关系，通过相应的光刺激，使表达光敏感通道蛋白的神经元膜内外电位发生变化，从而改变神经元的活动状态，实现高时空精度的开关(兴奋，正常，抑制)功能。此外，光遗传技术也被科研人员用于心脏光起搏，并研究其在心脏中的价值。心脏光遗传学是一个新兴的研究方向，一般是指将源于绿藻(chlamydomonas reinhardtii)的光敏感蛋白视紫红质通道蛋白ChR2特异性表达于心肌细胞上，通过蓝光照射使ChR2 通道开放，胞外阳离子流入细胞内，使细胞膜电位去极化，从而引发心肌细胞产生动作电位，电活动可以从少数心肌细胞向周围相邻的心肌细胞传导，最终使整个心脏兴奋和收缩，从而实现光控小鼠心脏起搏模型的搭建。近几年来，光遗传学在可控的基因编辑、基因治疗及细胞治疗领域也取得了一系列进展。2017年，叶海峰课题组开发了远红光调控转基因表达控制系统。实现只需一束远红光即可调控基因表达。利用多学科技术交叉，建立了通过智能手机APP超远程调控人工定制胰岛细胞治疗糖尿病的电子药物平台。在2018年，他们将远红光调控转基因表达控制系统与CRISPR
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dCas9基因编辑两大技术相结合，开发出了远红光调控的 CRISPR
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dCas9内源基因转录激活装置(FACE)。随后他们相继开发出了光控的分割型Cre
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loxp系统(FISC)以及光控的非离子通道类遗传开关(REDMAP)。可以实现精准调准细胞信号通路、高效调控细胞和小鼠内源基因的表达、动物体内的血糖稳态控制等。目前关于光遗传的这些研究进展不仅扩展了哺乳动物细胞基因编辑的光遗传学工具，还加速了光遗传学从基础研究向生物医学转化研究的进展。
[0004]然而，目前几种主要的光敏蛋白和其对应的相应光波长分别如下：ChR2
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蓝光 460nm；嗜盐碱菌里发现的Halorhodopsin(NphR盐系菌视紫红质)
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黄光593nm；苏打盐红菌里发现的Arch(古紫质)
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黄绿光566nm；ΔphyA
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660nm+730nm。由于生物组织对这些光能的
强烈吸收和散射，这些位于可见区的光很难穿透生物组织，比如蓝光仅能穿透约1个毫米左右的生物组织。这种实质性的局限性以及长时间的可见光暴露还会引起细胞毒性，突出表明了将这些光诱导的光敏蛋白应用于体内研究应用和临床转化的难度。此外，光遗传中大多数的光控设备还存在有创、高成本、操纵复杂以及误差过大等限制，比如使用光纤从外部光源传递光不仅刺激区域有限、通道单一、对活体造成损伤，还会导致空间位阻，可能干扰动物的自然运动，并阻碍对复杂行为背后的神经回路的研究。头戴式、背带式的设备也或多或少对动物行为造成干扰而导致实验数据偏移。
[0005]近些年来，随着纳米生物技术的发展，纳米材料在生物分子检测、生物成像以及疾病诊疗等方面的应用越来与广泛。尤其稀土基纳米材料因其高荧光强度、低成本、快速反馈、高灵敏、无辐射等特点在生物应用领域中展示出了卓越的优势。稀土离子有5s轨道和5p轨道的保护，因此环境对稀土离子荧光的影响非常微弱，这使得其荧光发射光谱谱线尖锐(强度高、发射峰窄)且稳定。此外，不同稀土离子的掺杂组合使最终纳米粒子的发射谱带更具可定制性，如可以同时实现双近红外光源激发的LaF3:Nd,Yb,Er，还有单光源激发红绿光双色荧光的CaF2:Yb,Er，它们可以在吸收近红外光后，发射出高效的上转换可见光荧光。这些特性使得稀土基纳米材料可以作为一种中继介导材料，将具有组织穿透相对深特性的近红外光应用于光遗传学技术，在满足后者向深层组织传导光学信号的需要的同时还可以极大程度减少对生物组织的创伤。2015年，日本仙台东北大学的HiromuYawo 首次证实了在稀土基纳米材料NaYF4:Sc,Yb,Tm的介导下，在细胞爬片上可以通过近红外光有效调控神经元的活性。早期关于稀土基纳米材料介导的光遗传应用探索主要还是停留在体外。2017年，中国香港城市大学史鹏首次将稀土基纳米材料 NaYF4:Yb,Er@NaYF4介导的光遗传方法应用在了啮齿类哺乳动物中，实现了小鼠中枢神经系统的无线光调控。更进一步，日本理化研究所的Chen在2018年将 NaYF4:Yb,Tm@SiO2纳米粒子注射到小鼠双侧VTA区，通过近红外激发光照射，展示了该技术在神经疾病治疗方面的应用潜力，这是目前对稀土基纳米材料介导的无线光遗传学技术在体内应用最深入的研究。虽然基于稀土基近红外纳米材料介导的光遗传的研究很大程度的改善了对于生物体的损伤，但其应用还是面临着一些局限。在该方法中，一种材料体系只能针对一种视蛋白来对神经元介导刺激以对其功能进行研究，并且一种材料体系必须单独配置与之相匹配的光照刺激系统，当改变研究目标神经元所使用的视蛋白时，不仅需要重新设计合成介导纳米材料体系，还需要重新配置匹配的光照刺激系统并再次进行活体的立体定位注射，这不仅会大幅增加实验的耗时、成本以及操作复杂度，还会由于多次的注射增加对生物组织的损伤和感染风险。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法。能够解决现有光遗传领域中的有创、低效率、单一化以及高成本等问题，能够同时实现对两种目标神经细胞的兴奋或抑制的独立光遗传操控。
[0007]本专利技术的构思是：
[0008]本专利技术针对所选用的不同类型的具有不同光响应波段的光敏蛋白设计合成与之匹配的稀土基近红外纳米材料作为其中继激发光源。通过病毒载体并结合特异启动子的遗传学方法将两种不同的光敏蛋白(兴奋型/兴奋型、兴奋型/抑制型、抑制型/抑制型)分别表
达在所选定的两种目标神经细胞膜上。利用脑立体定位注射方式，将两种设计合成的与其响应波段相匹配的近红外中继纳米材料转至对应的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于稀土基近红外纳米材料中继的双通道光遗传方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、将两种稀土基近红外纳米材料分别作为两种目标神经细胞的中继激发光源，所述两种目标神经细胞表达有特定光敏蛋白；步骤2、使用近红外激发光源对分布有目标神经细胞的区域进行非侵入式无创光照刺激，两种稀土基近红外纳米材料分别将近红外激发光源转换成为可被相应特定光敏蛋白接收响应的可见光，使光敏蛋白被激活，实现两种目标神经细胞的兴奋或抑制的独立控制。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述两种目标神经细胞表达不同光响应波段的光敏蛋白；步骤2采用单一近红外激发光源对目标区域进行非侵入式的无创光照刺激，目标区域的两种稀土基近红外纳米材料分别将单一波长近红外激发光源转换成为可被相应光敏蛋白接收响应的可见光，使光敏蛋白被激活，从而实现利用单一波长近红外激发光源同时对两种目标神经细胞的调控。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述两种稀土基近红外纳米材料为：NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4和NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaGdF4；所述近红外激发光源波长位于977
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985nm之间；对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：ChR2和eBR；或，Mac和eBR；或C1V1和ChR2。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述近红外激发光源波长为980nm。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述两种稀土基近红外纳米材料为：NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd和NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；所述近红外激发光源波长位于799
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811nm之间；对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：C1V1和ChR2；或，ChR2和eBR；或，Mac和eBR。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述近红外激发光源波长为808nm。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，所述两种目标神经细胞表达有不同光响应波段的光敏蛋白；步骤2采用两种近红外激发光源对目标区域进行非侵入式的无创光照刺激，目标区域的两种稀土基近红外纳米材料分别将近红外激发光源转换成为可被相应的表达在不同神经元上的具有不同光响应波段的光敏蛋白接收的可见光，使光敏蛋白被激活，从而实现利用两种不同波长近红外激发光源对两种不同目标神经细胞的独立调控。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述两种稀土基近红外纳米材料为：NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaGdF4和NaYF4:Yb,Er@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@NaGdF4:Nd；对应两种近红外激发光源波长分别位于974
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985nm，798
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812nm；对应两种目标神经细胞表达的光敏蛋白分别为：C1V1和ChR2，或ChR2和eBR，或Mac和eBR。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：对应两种近红外激发光源波长分别为980nm和808nm。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述两种稀土基近红外纳米材料为：NaYF4:Tm@NaLuF4:Yb@NaLuF4:Nd@N...

【专利技术属性】
技术研发人员：王荃，范琪，胡炳樑，
申请(专利权)人：中国科学院西安光学精密机械研究所，
类型：发明
国别省市：