一种细胞微膜片制备器件及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞微膜片制备器件，包括培养细胞的基材，基材上修饰有温敏性聚合物，温敏性聚合物上图案化修饰有抗细胞粘附剂作为隔离带，以此将修饰有温敏性聚合物的基材表面分隔为若干块相互独立的区域。由于抗细胞粘附剂的作用，细胞无法在修饰有抗细胞粘附剂的区域生长，通过抗细胞粘附剂的隔离作用，从而将培养的细胞分隔为一块一块相互独立的微膜片，培养结束后，利用温敏性聚合物的温变特性，可自动收获一块块细胞微膜片，无需洗涤和物理切割。本发明专利技术避免了在收获细胞时胰酶或胰酶替代物的使用，最大限度上保护了细胞连接与细胞外基质的完整性，有利于提升干细胞活性和存活率，增加其在靶向部位的滞留性，最终提升干细胞治疗效果。干细胞治疗效果。干细胞治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞微膜片制备器件及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物材料
，更具体地，涉及一种细胞微膜片制备器件及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]细胞由于其自我更新和多系分化潜力，在组织修复与再生方面的应用得到了广泛的研究。根据美国国立卫生研究院管理的临床研究登记系统(Clinicaltrials.gov) 数据显示，截至2021年4月14日，全球登记的干细胞临床研究项目共计5822 项，其中有2451项已经完成临床试验研究。在过去的三年里(2018
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2020年)，国家药品评审中心(CDE)平均每年受理6个干细胞药物，其中绝大多数为干细胞注射液。干细胞注射液在收获细胞时，需要用到胰酶或胰酶替代物消化细胞，而细胞消化过程亦会破坏细胞连接与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，细胞外基质中含有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白、和弹性蛋白等对细胞的形态、粘附、迁移及分化起着巨大的调控作用的关键蛋白，这不仅使得细胞质量不断下降，也会导致细胞在注射移植后大量凋亡，此外，单细胞悬液注射后细胞流失严重，只有极少数细胞可以滞留在目标宿主组织处。
[0003]细胞膜片技术(cell sheet technology，CST)是一种无需支架的细胞移植方法，可无创性地获取细胞，避免了酶消化对细胞生物学功能的损伤，不仅保留了完整的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，同时还保留了重要离子通道和生长因子受体等，可以促进细胞间及细胞与胞外基质间的相互作用。关于细胞膜片的制备，Okano(Matsuura,K.；Haraguchi,Y.；Shimizu,T.；Okano,T.,Cell sheettransplantation for heart tissue repair.Journal of Controlled Release,2013,169(3): 336
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340.)公开了在组织培养皿的表面修饰一层温敏性聚合物聚(N
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异丙基丙烯酰胺)PNIPAM，在温度为20℃时，PNIPAM修饰过的组织培养皿表面呈亲水性，不适合细胞粘附；在温度为37℃时，表面呈疏水性，适合细胞的粘附与增殖。因此，当接种细胞并培养至汇合后，不需要经过细胞消化步骤，仅通过改变培养温度便可以得到完整的细胞膜片，然而其制备的细胞膜片尺寸较大，以治疗扩大性心肌为例，其使用的细胞膜片尺寸高达4cm，使用时需要4张膜片叠加使用，移植过程更是需要通过胸廓切开术，过于复杂的移植过程极大的限制了其临床应用场景。Hsing
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Wen Sung(Chen,C.H.；Chang,Y.；Wang,C.C.；Huang,C.H.；Huang, C.C.；Yeh,Y.C.；Hwang,S.M.；Sung,H.W.,Construction and characterization offragmented mesenchymal
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stem
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cell sheets for intramuscular injection.Biomaterials2007,28,4643
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4651.)对细胞膜片技术做了进一步的改进，提出了一种利用甲基纤维素水凝胶制备破碎的间充质干细胞膜片(fragmented mesenchymal
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stem
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cellsheets)技术，首先在细胞培养皿上铺上一层甲基纤维素溶液(其具有温敏性，在37℃时为固态，在20℃或者更低温度时则转变为溶液状态)，然后在37℃培养箱中放置一小时，使其凝固为凝胶，之后在凝胶上涂覆一层一型胶原涂层，使其适合细胞的粘附与增殖。接种间充质干细胞，待细胞长满变成细胞膜片后用特制的铁丝网对凝胶体系进行切割，之后用冷的PBS溶液(使甲基纤维素由凝胶态转变为溶液
(TCPS)、细胞培养瓶、细胞培养滚瓶、聚酰胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁酯、聚甲醛树脂、聚碳酸树脂、聚苯醚、聚四氟乙烯、聚氨基甲酸乙酯、聚氧化乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚氯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯
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丙烯腈共聚物、丙烯腈
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丁二烯
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苯乙烯共聚物、乙烯
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醋酸乙烯酯共聚物中的至少一种。
[0014]本专利技术还提供上述任一所述细胞微膜片制备器件的制备方法，包括如下步骤：
[0015]S1.在培养细胞的基材表面修饰一层温敏性聚合物；
[0016]S2.在步骤S1修饰有温敏性聚合物的基材上再图案化修饰抗细胞粘附剂作为隔离带，通过图案化修饰将修饰有温敏性聚合物的基材表面分隔为若干块相互独立的区域，即得细胞微膜片制备器件。
[0017]优选地，在修饰温敏性聚合物前，可先用清洗液对基材进行清洗，所述清洗液选自去离子水、乙醇、一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、异丙醇、食人鱼洗液、石油醚、三氯乙烯、四氯乙烯中的至少一种；
[0018]优选地，步骤S1中修饰温敏性聚合物的方法包括电子束辐照、等离子体气相聚合、紫外线照射、溶剂浇铸、旋转涂布或启动化学气相沉积。
[0019]优选地，步骤S2中图案化修饰采用微接触印刷技术；例如通过PDMS印章转移图案。
[0020]优选地，当抗细胞粘附剂无法直接修饰在温敏性聚合物上时，可通过先修饰一层中间连接体，再利用中间连接体修饰抗细胞粘附剂；例如，当图案化修饰肝素钠时，先在温敏性聚合物层表面图案化修饰一层聚多巴胺，再将修饰完聚多巴胺的基材进一步与肝素钠反应，获得修饰有肝素钠的细胞微膜片制备器件。由于肝素钠呈负电性，因此细胞不会在其表面上粘附与增殖，培养至细胞汇合后，细胞在基材表面生长为一块一块被肝素钠修饰过的区域间隔开的微膜片形状。
[0021]本专利技术还提供上述任一所述细胞微膜片制备器件在制备细胞微膜片中的应用。
[0022]具体地，将细胞微膜片制备器件灭菌后，接种种子细胞，待细胞扩增结束后，降低温度，片状的细胞微膜片便会从细胞微膜片制备器件上脱落，从而收获细胞微膜片。所述细胞微膜片的制备方式避免了在收获细胞时胰酶或胰酶替代物的使用，最大限度上保护了细胞连接与细胞外基质的完整性，有利于提升干细胞活性和存活率，增加其在靶向部位的滞留性，最终提升干细胞治疗效果。
[0023]优选地，所述种子细胞包括但不限于脂肪干细胞、气道基底层细胞或者脐带间充质干细胞中的任一一种。
[0024]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0025]本专利技术的细胞微膜片制备器件，通过在修饰有温敏性聚合物的基材表面图案化修饰抗细胞粘附剂作为隔离带，从而将基材表面独立分隔为若干块相互独立的区域，从而使基材表面培养的细胞可被分隔为一块一块相互独立的微膜片形状，培养结束后，再利用温敏性聚合物的温变特性，低温下即可收获一块块独立的细胞微膜片，既不需要用动物源性的胶原进行涂层，也不需要用铁丝网进行物理切割，保证了微膜本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞微膜片制备器件，其特征在于，包括培养细胞的基材，基材上修饰有温敏性聚合物，温敏性聚合物上图案化修饰有抗细胞粘附剂作为隔离带，以此将修饰有温敏性聚合物的基材表面分隔为若干块相互独立的区域。2.根据权利要求1所述细胞微膜片制备器件，其特征在于，所述未修饰抗细胞粘附剂的区域边长尺寸或直径尺寸为10μm
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999μm。3.根据权利要求1所述细胞微膜片制备器件，其特征在于，所述温敏性聚合物为聚(N
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异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸N,N
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二甲基氨基乙酯、聚(2
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羧基异丙基丙烯酰胺)、聚环氧乙烷或聚(N，N
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二乙基丙烯酰胺)中的至少一种。4.根据权利要求1所述细胞微膜片制备器件，其特征在于，所述抗细胞粘附剂为肝素钠、聚乙二醇、聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠或海藻酸钠中的至少一种。5.根据权利要求1所述细胞微膜片制备器件，其特征在于，所述基材选择玻璃片、玻璃板、聚苯乙烯培养皿、细胞培养瓶、细胞培养滚瓶、聚酰胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁酯、聚甲醛树脂、聚碳酸树脂、聚苯醚、聚四氟乙烯、聚氨基甲酸乙酯、聚氧化乙烯、聚丙烯、聚乳酸、聚氯乙烯、聚甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：张智勇，宋李治，王文浩，
申请(专利权)人：广东瑞程医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：