钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用制造技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，且公开了钩吻素子在抑制骨质疏松药物中的应用，同时也公开了钩吻素子在抑制骨质疏松保健品中的应用。本发明专利技术利用了细胞培养、实时荧光定量PCR、细胞存活实验、TRAP染色、骨板吸收实验、蛋白免疫印迹实验以及卵巢切除引起的小鼠骨质疏松模型、H&E和TRAP染色以及Micro

【技术实现步骤摘要】
钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用


[0001]本专利技术涉及医药
，具体为钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用。

技术介绍

[0002]骨是由钙和磷酸盐结晶形成的有机蛋白基质与无机羟基磷灰石组成，通过成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收形成来进行修复，然而，形成和吸收之间的不平衡会导致许多疾病，包括类风湿关节炎、牙周炎和骨科植入物的无菌性松动。
[0003]绝经后骨质疏松症(PMO)是一种常见的骨疾病，以骨过度吸收为特征，破坏老年妇女骨平衡，目前，许多抗骨质疏松的药物对骨骼健康有积极作用，但往往伴随严重的副作用，如双膦酸盐导致的颌骨骨坏死和降钙素增加的肝癌风险，故而提出钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用来解决上述所提出的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于利用细胞培养、实时荧光定量PCR、细胞存活实验、TRAP染色、骨板吸收实验、蛋白免疫印迹实验以及卵巢切除引起的小鼠骨质疏松模型、H&E和TRAP染色以及Micro
‑
CT扫描等技术，证明钩吻素子在体外的作用机制和对小鼠卵巢切除所致骨丢失的保护作用，对未来发展骨质疏松药物有潜在价值。
[0005]本专利技术的第一方面，钩吻素子在抑制骨质疏松药物中的应用。
[0006]进一步的，本专利技术提供钩吻素子在抑制骨质疏松保健品中的应用。
[0007]进一步的，本专利技术钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用，所述钩吻素子通过抑制RANKL诱导的破骨细胞形成来防止小鼠卵巢切除引起的骨丢失。
[0008]进一步的，所述钩吻素子通过抑制IL
‑
6和TNF
‑
α的表达而显著缓解骨性关节炎和类风湿性关节炎的症状。
[0009]进一步的，所述钩吻素子具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等作用。
[0010]抑制骨质疏松药物，有效成分为钩吻素子。
[0011]抑制骨质疏松保健品中，有效成分为钩吻素子。
[0012]以钩吻素子为有效成分的抑制骨质疏松产品还可以制成各种制剂，包含但不限于片剂、胶囊、颗粒剂、注射液和冻干粉等。
[0013]本专利技术的有益效果在于：本专利技术利用了细胞培养、实时荧光定量PCR、细胞存活实验、TRAP染色、骨板吸收实验、蛋白免疫印迹实验以及卵巢切除引起的小鼠骨质疏松模型、H&E和TRAP染色以及Micro
‑
CT扫描等技术探讨了体外的作用机制和对小鼠卵巢切除所致骨丢失的保护作用，结果表明，钩吻素子对破骨细胞分化和功能的抑制作用，以及钩吻素子在体外的作用机制和对小鼠卵巢切除所致骨丢失的保护作用，对未来发展骨质疏松药物有潜在价值。
附图说明
[0014]图1中(A)钩吻素子的化学结构，(B)(C)不同浓度钩吻素子对破骨细胞的毒性；
[0015]图2中(A)随着浓度的增加钩吻素子对破骨细胞的抑制作用增强，(B)不同浓度钩吻素子下TRAP阳性细胞数量明显减少，(C)(D)不同浓度钩吻素子下TRAP阳性细胞面积和数量均小于对照组；
[0016]图3中(A)鬼笔环肽和DAPI染色下破骨细胞核数量和F
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action环面积(B)随着钩吻素子浓度的增加，细胞核数量减少，F
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action环面积减少(C)成熟破骨细胞培养于不同浓度钩吻素子羟基磷灰石的培养板示意图，(D)钩吻素子降低了羟基磷灰石涂层板表面单位面积吸收坑的百分比；
[0017]图4钩吻素子以剂量依赖的方式显著抑制TRAP、V
‑
ATPase
‑
d2和NFATc1基因的表达；
[0018]图5RANKL刺激(100ng/ml)60分钟RANKL诱导早期信号事件；
[0019]图6胫骨三维重建证实与OVX组相比，钩吻素子治疗组骨小梁丢失较少；
[0020]图7H&E和TRAP染色的胫骨切片分析图。
具体实施方式
[0021]下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例一：
[0023]1实验材料来源
[0024]钩吻素子(HPLC≥98％)从上海源叶生物技术有限公司购买，α
‑
MEM和血清(FBS)是从赛默飞(Thermo Fisher Scientific)购买，RANKL和M
‑
CSF从R&D Systems购买，TRAP染色试剂盒从浙江中技生物股份有限公司购买，PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计并合成，细胞骨架染色剂即Phalloidin
‑
iFluor 488Reagent(ab176753)从英国Abcam(Cambridge,UK)公司购买，Prime Script RT Master Mix(#RR036A)和TB Green Premix Ex Taq(RR420A)从日本Takara Bio Inc(Shiga Prefecture,Japan)公司购买。
[0025]2实验方法
[0026]2.1细胞培养
[0027]取4～6周龄C57BL/6小鼠，脱颈椎处死，无菌分离双侧胫骨和股骨；用无血清α
‑
MEM培养基冲洗无菌腔至发白，吹散细胞团；移入75平方厘米的培养瓶在37℃培养箱中培养，所用的α
‑
MEM培养基中含有10％的血清(FBS)，青霉素和链霉素的1％抗生素混合物，100ng/mL的M
‑
CSF，经过4天的培养之后便获得了破骨细胞。
[0028]2.2细胞活力测定
[0029]为了探究钩吻素子对BMMs的毒性情况，用细胞计数试剂盒(CCK
‑
8)测定不同浓度钩吻素子对BMMs的存活率的影响，用完全α
‑
MEM(含10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素抗生素混合物和M
‑
CSF(100ng/ml))，将BMMs接种到96孔板中，每孔密度为8000个细胞)，培养24小时后，更换培养基并在培养基中加入不同浓度的钩吻素子(0,3.125,6.25,12.5,25,50和
100μM)，每两天更换一次培养基，细胞孵育96小时后，吸出培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，在此基础上，在每孔中加入10μL的CCK
‑
8试剂盒溶液，在37℃下孵育4小时，用ELX800吸光度微板阅读器(Bio
‑
Tek，Winooski，Vt)测量450nm处的吸光度。
[0030]2.3破骨细胞形成和TRAP染色
[0031]用完全α
‑
MEM培养基(含10％胎牛血清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.钩吻素子在抑制骨质疏松药物中的应用。2.钩吻素子在抑制骨质疏松保健品中的应用。3.钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用，其特征在于，所述钩吻素子通过抑制RANKL诱导的破骨细胞形成来防止小鼠卵巢切除引起的骨丢失。4.根据权利要求3所述的钩吻素子在抑制骨质疏松产品中的应用，其特征在于，所述钩吻素子通过抑制IL
‑
6和TNF
‑
α的表达而显著缓解骨...

【专利技术属性】
技术研发人员：王勇，郭欢，邢春蕾，张晨曦，苏笠，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：