（2S）-顺-羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺制造技术

本发明专利技术涉及（2S）

【技术实现步骤摘要】
（2S）
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顺
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羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺


[0001]本专利技术涉及脂肪酶生产
，具体涉及（2S）
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顺
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羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺。

技术介绍

[0002]地尔硫卓，也叫做硫氮卓酮或哈氮，其属于非二氢吡啶类钙离子通道阻滞剂，作用机理介于苯烷胺类药物和二氢吡啶类药物这两种药物之间。由于地尔硫卓具有扩张小动脉血管、增加冠脉血流量、降低心率和血压的功效，其已经广泛应用于室上性心律失常、典型心绞痛、变异型心绞痛、老年性高血压等病症的治疗，并且地尔硫卓口服情况下吸收速度快、吸收效率高、治疗效果显著、副作用小，因此地尔硫卓已经成为临床上用于治疗高血压、冠心病、心绞痛的常用药物。
[0003]（2S）
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顺
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羟基内酰胺是地尔硫卓的关键中间体，目前，其合成工艺路线较为冗长，合成收率低，所产生的副产物对环境污染严重。申请人研发出一条新的（2S）
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顺
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羟基内酰胺合成工艺路线，该路线中通过脂肪酶对其进行酶促拆分，使得（2S）
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顺
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羟基内酰胺的合成步骤缩短，产品光学纯度高。为了配合（2S）
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顺
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羟基内酰胺的合成，脂肪酶的批量化生产也迫在眉睫。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了（2S）
‑
顺
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羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺，以提供一种（2S）
‑
顺
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羟基内酰胺新的合成工艺中所用到的脂肪酶的生产工艺。
[0005]本专利技术所采用的技术方案是：（2S）
‑
顺
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羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺，该生产工艺包括以下步骤：（1）一级种子培养；（2）二级种子培养；（3）发酵培养；（4）离心处理；其中，一级种子培养包括以下步骤：A1：投料：称取一定重量的一级培养基原料，加水溶解后将所得溶液加入一级种子罐中，向一级种子罐中加入一定体积的水，搅拌混合均匀，并添加碱液调整pH至6.5~7.5；A2：一级种子罐灭菌：保持搅拌的条件下，对一级种子罐升温，温度达到80
‑
100℃后停止搅拌；向一级种子罐中输送水蒸气，维持一级种子罐温度在121
±
1℃灭菌20min，停止水蒸气的输送，一级种子罐中的液体即为一级培养基，向一级种子罐内通入无菌空气并降低一级培养基的温度，同时通过调整空气进出量来维持一级种子罐内压力维持在0.03~0.08MPa，一级培养基温度维持29
‑
31℃；A3：接种；A4：一级种子培养控制：培养周期为5
‑
7h，在一级种子培养周期内维持一级培养基
的温度为29
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31℃，一级种子罐内压力为0.04
‑
0.06MPa，无菌空气流量为1.7
‑
1.9m
³
/h，低速搅拌，当OD
600
≥3时对移种管道灭菌。
[0006]优选地，一级种子培养中步骤A3包括以下步骤：a1：校准；即在接种前维持一级种子罐内一级培养基的温度为29
‑
31℃，低速搅拌，调整无菌空气的通气量为1.7
‑
1.9m
³
/h，一级种子罐内的压力为0.04
‑
0.06MPa；a2：将接种圈置于接种口处并加入乙醇（向哪里加乙醇），乙醇的体积分数不小于95%，通过一级种子罐的出气阀门调节其罐内压力至0.01MPa；点燃接种口内的乙醇并缓慢打开接种口，盛有浓度为50%的基因工程菌的烧瓶在火焰口打开瓶塞，的烧瓶在火焰口打开瓶塞，转动烧瓶一圈并将菌种缓缓倒入一级种子罐中；其中，基因工程菌为现有技术，购买于上海嘉楚生物工程有限公司，型号为编号SHBCC D10833。
[0007]a3：接种口塞在火焰中灼烧2~3s，旋紧接种口塞，熄灭火焰；调整一级种子罐的出气阀门使得罐内压力维持在0.04~0.06MPa。
[0008]优选地，所述的步骤（2）二级种子培养包括以下步骤：B1：投料：称取一定重量的二级培养基原料，加水溶解后将所得溶液加入二级种子罐中，向二级种子罐中加入一定体积的水，搅拌混合均匀，并添加碱液调整pH至6.5~7.5；B2：二级种子罐灭菌：保持搅拌的条件下，对二级种子罐升温，温度达到80
‑
100℃后停止搅拌；向二级种子罐中输送水蒸气，维持二级种子罐温度在121
±
1℃灭菌20min，停止水蒸气的输送，二级种子罐中的液体即为二级培养基，向二级种子罐内通入无菌空气并降低二级培养基的温度，同时通过调整空气进出量来维持二级种子罐内压力维持在0.04~0.06MPa，一级培养基温度达到29
‑
31℃；B3：移种；B4：二级种子培育控制：培养周期为5
‑
7h，在二级种子培养周期内维持二级培养基的温度为29
‑
31℃，二级种子罐内压力为0.04
‑
0.06MPa，无菌空气流量为25
‑
29m
³
/h，低速搅拌，并控制一级培养基的pH为6.5
‑
7.5。
[0009]优选地，所述的步骤B3中移种操作包括以下步骤：b1：校准；即在接种前维持二级种子罐内二级培养基的温度为29
‑
31℃，低速搅拌，调整无菌空气的通气量为25
‑
29m
³
/h，一级种子罐内的压力为0.04
‑
0.06MPa；b2：冲洗管路：用水蒸气对一级种子罐和二级种子罐之间的管路冲洗3~5min；b3：调整二级种子罐的出气阀使得罐内压力维持在0.02MPa~0.03MPa，同时调整一级种子罐的出气阀门使得其罐内压力维持在0.1Mpa，打开一级种子罐和二级种子罐之间的阀门，一级种子罐中的种子液经管路进入二级种子罐内。
[0010]优选地，所述的步骤（3）发酵罐培养包括以下步骤：C1：投料，向发酵罐中投入一定体积的饮用水，并向发酵罐中投入一定量的发酵培养基原料，搅拌均匀，通过向其中添加NaOH来调节发酵罐中pH维持在6.5~7.5;C2：发酵罐灭菌：保持搅拌的条件下，对发酵罐升温，温度达到80
‑
100℃后停止搅拌；向发酵罐中输送水蒸气，维持发酵罐温度在121
±
1℃灭菌25min，停止水蒸气的输送，发酵罐中的液体即为发酵培养基，向发酵罐内通入无菌空气并降低发酵培养基的温度，同时通过调整空气进出量来维持发酵罐内压力维持在0.03~0.08MPa，发酵培养基温度达到29.5~30.5℃；
C3：移种；C4：发酵罐培育控制：培育周期为20~30h，发酵罐中发酵培养基的温度维持在29.5~30.5℃，在发酵罐培育控制的前6个小时内发酵罐的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.（2S）
‑
顺
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羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺，其特征在于：该生产工艺包括以下步骤：（1）一级种子培养；（2）二级种子培养；（3）发酵培养；（4）离心处理；其中，一级种子培养包括以下步骤：A1：投料：称取一定重量的一级培养基原料，加水溶解后将所得溶液加入一级种子罐中，向一级种子罐中加入一定体积的水，搅拌混合均匀，并添加碱液调整pH至6.5~7.5；A2：一级种子罐灭菌：保持搅拌的条件下，对一级种子罐升温，温度达到80
‑
100℃后停止搅拌；向一级种子罐中输送水蒸气，维持一级种子罐温度在121
±
1℃灭菌20min，停止水蒸气的输送，一级种子罐中的液体即为一级培养基，向一级种子罐内通入无菌空气并降低一级培养基的温度，同时通过调整空气进出量来维持一级种子罐内压力维持在0.03~0.08MPa，一级培养基温度维持29
‑
31℃；A3：接种；A4：一级种子培养控制：培养周期为5
‑
7h，在一级种子培养周期内维持一级培养基的温度为29
‑
31℃，一级种子罐内压力为0.04
‑
0.06MPa，无菌空气流量为1.7
‑
1.9m
³
/h，低速搅拌，当OD
600
≥3时对移种管道灭菌。2.根据权利要求1所述的（2S）
‑
顺
‑
羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺，其特征在于：一级种子培养中步骤A3包括以下步骤：a1：校准；即在接种前维持一级种子罐内一级培养基的温度为29
‑
31℃，低速搅拌，调整无菌空气的通气量为1.7
‑
1.9m
³
/h，一级种子罐内的压力为0.04
‑
0.06MPa；a2：将接种圈置于接种口处，向接种口加入乙醇50ml，乙醇的体积分数不小于95%，通过一级种子罐的出气阀门调节其罐内压力至0.01MPa；点燃接种口内的乙醇并缓慢打开接种口，盛有菌种的烧瓶在火焰口打开瓶塞，转动烧瓶一圈并将菌种缓缓倒入一级种子罐中；a3：接种口塞在火焰中灼烧2~3s，旋紧接种口塞，熄灭火焰；调整一级种子罐的出气阀门使得罐内压力维持在0.04~0.06MPa。3.根据权利要求1所述的（2S）
‑
顺
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羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺，其特征在于：所述的步骤（2）二级种子培养包括以下步骤：B1：投料：称取一定重量的二级培养基原料，加水溶解后将所得溶液加入二级种子罐中，向二级种子罐中加入一定体积的水，搅拌混合均匀，并添加碱液调整pH至6.5~7.5；B2：二级种子罐灭菌：保持搅拌的条件下，对二级种子罐升温，温度达到80
‑
100℃后停止搅拌；向二级种子罐中输送水蒸气，维持二级种子罐温度在121
±
1℃灭菌20min，停止水蒸气的输送，二级种子罐中的液体即为二级培养基，向二级种子罐内通入无菌空气并降低二级培养基的温度，同时通过调整空气进出量来维持二级种子罐内压力维持在0.04~0.06MPa，一级培养基温度达到29
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31℃；B3：移种；B4：二级种子培育控制：培养周期为5
‑
7h，在二级种子培养周期内维持二级培养基的温度为29
‑
31℃，二级种子罐内压力为0.04
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0.06MPa，无菌空气流量为25
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29m
³
/h，低速搅拌，
并控制一级培养基的pH为6.5
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7.5。4.根据权利要求3所述的（2S）
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顺
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羟基内酰胺合成用脂肪酶的生产工艺，其特征在于：所述的步骤B3中移种操作包括以下步骤：b1：校准；即在接种前维持二级种子罐内二级培养基的温度为29
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31℃，低速搅拌，调整无菌空气的通气量为25
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29m
³
/h，一级种子罐内的压力为0.04
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0.06MPa；b2：冲洗管路：用水蒸气对一级种子罐和二级种子罐之间的管路冲洗3~5min；b3：调整二级种子罐的出气阀使得罐内压力维持在0.02MPa~0.03MPa，同时调整一级种子罐的出气阀门使得其罐内压...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭彦超，周超，罗学东，董振，郭陆军，周迪，
申请(专利权)人：巨鑫生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：