脂肪酶修饰的菌株制造技术

本发明专利技术涉及一种产生类视黄醇的宿主细胞，特别是油质酵母，该宿主细胞经修饰为使得在使用甘油三酯油(如例如植物油)作为碳源进行发酵期间，基于由此类宿主细胞产生的总类视黄醇的视黄醇乙酸酯的百分比增加，其中降低或消除了某些参与非期望的视黄醇或视黄醇乙酸酯转换的内源性水解酶或转移酶的活性。特别地，此类经修饰的宿主细胞可能可用于生产维生素A的生物技术过程。生物技术过程。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脂肪酶修饰的菌株
[0001]本专利技术涉及一种产生类视黄醇的宿主细胞，特别是油质酵母，该宿主细胞经修饰为使得在使用甘油三酯油(如例如植物油)作为碳源进行发酵期间，基于由此类宿主细胞产生的总类视黄醇的视黄醇乙酸酯的百分比增加，其中降低或消除了某些参与非期望的视黄醇或视黄醇乙酸酯转换的内源性水解酶或转移酶的活性。特别地，此类经修饰的宿主细胞可能可用于生产维生素A的生物技术过程。
[0002]类视黄醇，包括维生素A，是必须经由营养品供应给人类的非常重要且不可缺少的营养因子之一。类视黄醇促进人类的健康，尤其是在视觉、免疫系统和生长方面。视黄醇乙酸酯是维生素A生产过程中的重要中间体或前体。
[0003]目前用于类视黄醇(包括维生素A及其前体)的化学生产方法具有一些不期望的特性，诸如高能耗、复杂的纯化步骤和/或不期望的副产物。因此，在过去的几十年中，已经研究了其他制造类视黄醇(包括维生素A及其前体)的方法，所述方法包括微生物转换步骤，这将导致更经济以及更环保的维生素A生产。
[0004]通常，产生类视黄醇的生物系统在工业上难以处理，且/或以低水平产生化合物，使得商业规模的分离是不实际的。最大的限制因素包括此类生物系统中中间体的不稳定性和/或副产物(例如视黄基脂肪酸酯)的相对高产量，特别是当使用在作为碳源的植物油上生长的油质宿主细胞时。
[0005]WO2019/058000描述了一种使用在玉米油上生长的产生类胡萝卜素的宿主细胞，从β
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胡萝卜素到视黄醇和视黄醇乙酸酯(一种被认为比视黄醇更稳定的中间体)的新颖发酵方法，所述宿主细胞表达异源β
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胡萝卜素氧化酶(beta
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carotene oxidase,BCO)、视黄醛还原酶(retinal reductase,RDH)和乙酰转移酶(acetyl
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transferase,ATF)。然而，由这种油质宿主细胞产生的相对高百分比的视黄醇因维生素A生产而“损失”，即被宿主细胞的内源行水解酶和/或转移酶催化而转换成非期望的副产物。
[0006]因此，改善视黄醇转换成视黄醇乙酸酯(维生素A生产中的一种稳定中间体)的发酵过程的产物特异性和/或生产率是一项持续存在的任务。特别地，期望开发一种优选使用在植物油上生长的油质宿主细胞、具有有限的副产物形成和最大的视黄醇乙酸酯积聚，而不损害所述宿主细胞的生长的发酵方法。
[0007]令人惊讶的是，我们现在发现对宿主细胞，特别是油质酵母的修饰，即对参与将植物油预消化成甘油和脂肪酸的某些酶的修饰，特别是阻断，可导致视黄醇乙酸酯形成增加，即与使用相应的未修饰宿主细胞的方法相比，基于总类视黄醇的视黄醇乙酸酯的百分比可增加至少约30％，例如增加至在约70
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90％或更高范围内的百分比。
[0008]特别地，本专利技术涉及一种能够形成视黄醇乙酸酯的产生类视黄醇的宿主细胞，例如真菌宿主细胞，优选油质酵母细胞，例如耶氏酵母属(Yarrowia)，所述宿主细胞包含一种或多种遗传修饰，即降低或消除，优选地消除某些编码水解酶或转移酶的内源基因，特别地包括例如编码内源脂肪酶和/或酯酶的基因，包括但不限于对与SEQ ID NO:5具有至少约50％，例如60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％同一性的内源基因的活性的修饰，其中SEQ ID NO:5对应于可从解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)获得的LIP8。
[0009]在一个方面中，本专利技术涉及一种使用本文所定义的此类经修饰的宿主细胞的发酵方法，所述宿主细胞在作为碳源的甘油三酯油(如例如植物油，例如玉米油)上生长，其中由视黄醇转换形成的视黄醇乙酸酯增加，从而导致基于所述经修饰的宿主细胞中存在/由所述经修饰的宿主细胞产生的总类视黄醇，视黄醇乙酸酯的百分比为约至少70％，例如约75％、80％、85％、90％、95％、98％或更多，包括100％。
[0010]根据本专利技术的要被修饰的合适内源性水解酶或转移酶可以选自具有脂肪酶和/或酯酶活性的酶。术语“脂肪酶”在本文中与术语“酯酶”或“具有脂肪酶和/或酯酶活性的酶”可互换使用。它是指通常在油质宿主细胞中表达的参与将甘油三酯油(如例如植物油)预消化成甘油和脂肪酸的酶。如本文所定义的在宿主细胞中要被修饰的合适的酶可以选自属于EC类3.1.1.
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的内源酶，包括但不限于一种或多种具有与耶氏酵母属LIP2、LIP3、LIP8、TGL1、LIP16、LIP17、LIP18或LIP4活性对应的酶。
[0011]如本文所用，具有与耶氏酵母属中的相应LIP活性对应的活性的酶不仅包括来源于耶氏酵母属(例如解脂耶氏酵母，例如耶氏酵母属LIP2、LIP3、LIP8、TGL
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1、LIP16、LIP17、LIP18、LIP4或它们的组合)的基因，而且还包括具有等同酶活性但来源于另一来源生物体的酶，特别是来源于产生视黄醇乙酸酯的油质宿主细胞的酶，其中对此类等同内源基因的修饰将导致如本文所定义的视黄醛至视黄醇乙酸酯转换增加。
[0012]本专利技术涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞在某些内源性水解酶/转移酶活性上被修饰，从而导致如本文所定义的维生素A发酵过程中的视黄醇乙酸酯增加。待修饰的合适宿主细胞选自产生类视黄醇的宿主细胞，特别是产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞，其中视黄醇乙酸酯是经由由乙酰化酶(acetylating enzyme,ATF)催化视黄醇的酶促转化而形成的，例如真菌宿主细胞，包括油质酵母细胞，例如红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、油脂酵母属(Lipomyces)或耶氏酵母属，优选耶氏酵母属，更优选解脂耶氏酵母，其中经由如本文所定义的对所述内源酶活性(例如脂肪酶和/或酯酶活性)的修饰，视黄醇至视黄醇乙酸酯的转换被增强，导致基于细胞中总类视黄醇的视黄醇乙酸酯的百分比增加了至少约10％，并且其中所述修饰包括遗传修饰，例如降低/消除编码某些耶氏酵母属脂肪酶/酯酶的内源基因的活性或来自如本文所指定的其它油质宿主细胞的对应内源酶活性，包括但不限于对应基因的缺失。
[0013]如本文所定义，“经修饰的宿主细胞”与“野生型宿主细胞”相比较，“野生型宿主细胞”即在所定义的酶活性方面没有此类修饰的相应宿主细胞，即其中所述对应的内源酶(仍然)在体内表达并有活性。
[0014]在一个实施方式中，本专利技术提供了一种经修饰的宿主细胞，例如经修饰的产生视黄醇乙酸酯的油质宿主细胞，所述宿主细胞包含对与SEQ ID NO:5具有至少约50％，例如60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％同一性的多肽的修饰，包括但不限于可获自解脂耶氏酵母的LIP8，其中所述多肽的活性被降低或消除，优选被消除，包括基因表达的降低或消除，其中在作为碳源的甘油三酯油(例如植物玉米油)存在下的发酵中使用此类经修饰的宿主细胞导致视黄醇转换成的视黄醇乙酸酯的百分比增加，例如基于如本文所定义的相应宿主细胞中存在的总类视黄醇，有至少约70％的视黄醇乙酸酯。特别地，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种能够形成视黄醇乙酸酯的产生类视黄醇的宿主细胞，特别是产生视黄醇乙酸酯的宿主细胞，例如真菌宿主细胞，优选油质酵母细胞，例如耶氏酵母属，所述宿主细胞包含一种或多种遗传修饰，例如降低或消除，优选消除参与将植物油预消化成甘油和脂肪酸的内源酶，优选属于EC 3.1.1.
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类的内源酶，更优选具有酯酶或脂肪酶活性的酶。2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中内源基因的表达被降低或消除，优选被消除，所述基因编码具有与选自由耶氏酵母属LIP2、LIP3、LIP4、LIP8、TGL1、LIP16、LIP17、LIP18以及它们的组合组成的组的酶活性对应的活性的酶。3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其中所述修饰导致与其中所述相应基因仍被表达和有活性的宿主细胞相比，基于总类视黄醇，视黄醇乙酸酯的百分比增加到至少约70％，例如至少约70
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90％。4.根据权利要求1至3中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞包含对可从解脂耶氏酵母获得的与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15以及它们的组合组成的组的多肽具有至少约50％，例如60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％同一性的多肽的修饰。5.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞，其中与耶氏酵母属LIP8对应的内源酶被降低或消除，优选被消除。6.根据权利要求1至5中任一项所述的宿主细胞，其中与使用所述相应的未修饰的宿主细胞的视黄醇乙酸酯形成相比，在发酵期间视黄醇乙酸酯的形成增加，并且其中获得了基于所述经修饰的宿主细胞中存在/由所述经修饰的宿主细胞产生的总类视黄醇，视黄醇乙酸酯的百分比为至少约70％，例如约75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高，包括100％。7.根据权利要求1至6中任一项所述的宿主细胞，所述宿主细胞用于以植物油作为碳源产生类视黄醇的发酵过程中，其中基于所述宿主细胞中存在或由所述宿主细胞产生的总类视黄醇，所述类视黄醇混合物中存在的视黄醇乙酸酯的百分比为约70％或更高，优选约75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高，包括100％。8.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自耶氏酵母属，优选解脂耶氏酵母，包含LIP8基因的失活，优选缺失，任选地结合选自由LIP2、LIP3、LIP4、TGL、LIP16、LIP17、LIP18以及它们的组合组成的组的基因的失活，优选缺失。9.根据权利要求1至8中任一项所述的宿主细胞在用于产生类视黄醇的方法中的用途，所述类视黄醇选自由视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄基脂肪酸酯、维生素A或它们的混合物组成的组。10.根据权利要求9所述的用途，其中基于所述类视黄醇的总量，视黄醇乙酸酯的百分比在约70％或更高的范围内。11.根据权利要求9或10所述的用途，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：珍娜，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：