修饰NF-YC4启动子的转录抑制子结合位点以增加蛋白质含量和抗应力制造技术

在包含NF

【技术实现步骤摘要】
修饰NF
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YC4启动子的转录抑制子结合位点以增加蛋白质含量和抗应力
[0001]本申请是申请号为201680022422.6，申请日为2016年02月17日，题目为“修饰 NF
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YC4启动子的转录抑制子结合位点以增加蛋白质含量和抗应力”的专利申请的分案 申请。
[0002]关于联邦资助的研究或开发的声明
[0003]本文所述工作至少部分由来自美国国家科学基金会的拨款支持，MCB授予号为 0209789和0951170。因此，美国政府对本专利技术拥有一定权利。


[0004]本公开涉及增加真核细胞的蛋白质含量，提高植物对胁迫，如非生物(例如盐、干 旱和污染)或生物(如病原体和害虫)胁迫，的抗性，有经修饰的转录抑制子结合位点的启 动子，使得转录抑制子无法阻碍基因NF
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YC4的转录，QQS，TALENS，CRISPR/Cas9， 组织培养物，杂交和回交植物，杂交种植物，可再生细胞和种子。
[0005]专利技术背景
[0006]蛋白质缺乏是发展中国家中的主要健康问题。低蛋白摄入每年在数亿儿童中引起智 力迟钝、发育迟缓、疾病易感性、消耗病和/或死亡(Forrester等,PloS one 7:e35907(2012)； Gomes等,J.Neuroscience Res.87:3568
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3575(2009))。
[0007]植物提供超过60％的人膳食蛋白质(Young等,Am.J.Clin.Nutr.59:1203S<br/>‑
1212S (1994))。增加主要作物的蛋白质含量能帮助缓解蛋白质缺乏，尤其是当使用动物产生等 量蛋白时需要约100倍的水和11倍的能量(Pimentel等,Am.J.Clin.Nutr.78:6605
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6635 (2003))且增加动物蛋白质含量通常伴随着蛋白质质量或产率减少(Bellaloui等, Agricultural Sciences 1:110
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118(2010)；Wenefrida等,J.Agricultural Food Chem.61: 11702
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11710(2013))。
[0008]拟南芥QQS(At3g30720,Qua
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Quine Starch)孤独基因调节拟南芥蛋白质含量。拟南芥 淀粉合酶3(Atss3)突变体与野生型(WT)对照系在形态上相似但淀粉水平不同(Zhang等, Plant Physiol.138:663
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674(2005))，具有比WT中所发现的超过5倍的QQS转录物的量 (Li等,Plant J.58:485
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498(2009))。拟南芥中的QQS过表达提高叶的总蛋白质含量并降 低总淀粉含量，同时QQS下调具有逆效应(Li等,Plant Biotech.J.13:177
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187(2015)；Li 等.(2009),同上)。作为转基因的QQS表达提高其它植物的蛋白质含量，如大豆(Williams82变种；Li等(2014)，同上；Li等(2009)，同上)。
[0009]观察到QQS表达与多种发育、环境和遗传学扰动紧密联系(参见例如Arendsee等, Trends in Plant Sci doi:10.1016/j.tplants.2014.07.003(2014)；Li等(2009),同上；和Li等 (2015),同上)。然而，其在这类扰动中的作用尚未阐明。例如，PEN3(PenetrationResistance 3(Atlg59870、PEN3、ABC结合盒转运子基因)赋予对真菌和卵菌病原体的非 宿主抗性。据报道，QQS是在pen3敲除(KO)突变体中上调的唯一基因；然而，QQS在 感染和非感染突变体中上调(Stein等,Plant Cell 18(3):731
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746(2006))。作为另一示例，2 种突触融合蛋白即SYP121(At3gl l820,PEN1)和SYP122(At3g52400)赋予对白粉菌的抗 性。这些
基因的敲除体引起对这些病原体的敏感性增加；QQS据报道是在两者中都上调 的唯一基因(Zhang等(2008))。相反，PEN3和EXLl在暴露于一些病原体后上调，QQS 响应一些病原体感染而下调，如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)(Kwon等,Planta236(3):887
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900(2012)；和Thilmony等,Plant J.46(1):34
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53(2006))。当用Phytoptherainfestans接种拟南芥植物时，QQS据报道首先在接种后6小时下调，然后在接种后12 和24小时上调(Scheel等,ArrayExpress的实验ID是"E
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GEOD
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5616")。
[0010]因此，鉴于上述情况，本公开的目的是鉴定与QQS相互作用的基因。在拟南芥中， QQS与核因子Y亚基C4(NF
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YC4,At5g63470)相互作用。另一目的是提供用于操作所鉴 定基因的材料和方法。在实施方案中，操作这种基因引起蛋白质含量增加和/或碳水化合 物含量减少。另一目的是提供用于提高植物对病原体或害虫抗性的材料和方法。这些和 其它目的以及专利技术特征通过本文所提供的详细描述是显然的。

技术实现思路

[0011]提供在包含NF
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YC4基因的真核细胞中增加蛋白质含量的方法，所述基因包含启动 子，所述启动子包含转录抑制子结合位点。所述方法包括修饰转录抑制子结合位点，从 而转录抑制子无法阻碍NF
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YC4转录。真核细胞的蛋白质含量增加；因此，该方法还可 以包括就蛋白质含量增加进行选择。所述方法还可以包括从真核细胞产生细胞集合、组 织、器官或生物体。真核细胞可以是细胞集合、组织、器官或生物体的部分。生物体可 以是植物，如农作物，如大豆、水稻、玉米等。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。 转录抑制子结合位点能通过缺失修饰。转录抑制子结合位点可以包含ERF基序、RAV 1 基序或ERF基序和RAV 1基序两者，基本由其组成，或由其组成。真核细胞可以是水 稻细胞和(i)缺失2个ERF基序，(ii)缺失RAV 1基序，或(iii)缺失RAV 1基序和ERF 基序。真核细胞可以是大豆细胞，(i)缺失2个RAV 1基序或(ii)缺失RAV 1基序和ERF 基序。ERF基序、RAV 1基序或ERF基序和RAV 1基序两者能用TALENS或CRISPR/Cas9 缺失。
[0012]还提供产生蛋白质含量增加的植物的方法。所述方法包括将根据上述方法所得植物 与第二植物杂交以产生后代植物和选择蛋白质含量增加的后代植物。该方法还能包括将 选定的后代植物与第二植物杂交以产生回交后代植物，选择蛋白质含量增加的第一回交 后代植本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
Starch(QQS)多肽的核苷酸序列的多核苷酸引入所述植物细胞或植物并在其中表达，所述多肽具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列与启动子可操作连接。17.如权利要求16所述的方法，其进一步包括从所述植物细胞再生植物。18.如权利要求14或16所述的方法，其中所述病原体是细菌或病毒且其中所述害虫是蚜虫。19.如权利要求14或16所述的方法，其中所述植物是大豆。20.一种产生对病原体或害虫抗性增加的植物的方法，所述方法包括将根据权利要求14、15、16或17的方法获得的植物与第二植物杂交以产生后代植物和选择对病原体或害虫抗性增加的后代植物，从而产生对病原体或害虫抗性增加的植物。21.如权利要求20所述的方法，其中所述转录抑制子结合位点包含ERF基序、RAV1基序或ERF基序和RAV 1基序两者。22.如权利要求21所述的方法，其中所述植物细胞或植物是水稻细胞或水稻植物并且(i)缺失2个ERF基序，(ii)缺失RAV 1基序，或(iii)缺失RAV 1基序和ERF基序。23.如权利要求21所述的方法，其中所述植物细胞或植物是大豆细胞或大豆植物并且(i)缺失2个RAV 1基序或(ii)缺失RAV 1基序和ERF基序。24.如权利要求21所述的方法，其中用TALENS缺失ERF基序、RAV 1基序或ERF基序和RAV 1基序两者。25.如权利要求21所述的方法，其中用CRISPR/Cas9缺失ERF基序、RAV 1基序或ERF基序和RAV 1基序两者。26.如权利要求20所述的方法，其中所述方法进一步包括将选择的后代植物与所述第二植物杂交以产生回交后代植物，选择对病原体或害虫抗性增加的第一回交后代植物以产生选择的回交后代植物，和重复3次或更多次杂交和选择以产生对病原体或害虫抗性增加的回交后代植物。27.一种产生植物的方法，包括修饰其中的NF
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YC4基因的启动子中的转录抑制子结合位点，使得转录抑制子不能阻碍NF
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YC4基因的转录，其中所述植物中对病原体或害虫的抗性增加。28.如权利要求27所述的方法，其中所述植物的野生型不包含和表达QQS，并且向所述植物中引入包含编码QQS多肽的核苷酸序列的多核苷酸并在其中表达，所述多肽具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列与启动子可操作连接。29.一种产生种子的方法，其包括从根据权利要求27或28所述的方法获得的植物获得种子。30.一种产生杂交种的方法，其包括将根据权利要求27或28所述的方法获得的植物与第二植物杂交。31.一种产生种子的方法，其包括从根据权利要求30所述的方法获得的杂交种植物获得种子。32.一种增加植物或其部分中的蛋白质含量的方法，包括在所述植物或其部分中过表达NF
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YC4基因，其中在所述植物或其部分中至少蛋白质含量比没有过表达NF
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YC4基因的相应的野生型(WT)植物或其相应的WT部分中的蛋白质含量更高。33.如权利要求32所述的方法，其中所述植物或其部分是大豆。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述植物或其部分是玉米。35.如权利要求32所述的方法，其中所述植物或其部分是水稻。36.如权利要求32
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35任一项所述的方法，其中所述NF
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YC4基因是转基因。37.如权利要求32
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35任一项所述的方法，其中所述NF
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【专利技术属性】
技术研发人员：李灵，E，
申请(专利权)人：衣阿华州立大学研究基金公司，
类型：发明
国别省市：