一种白细胞介素16蛋白的新用途制造技术

本发明专利技术公开了一种白细胞介素16蛋白的新用途，即其在制备抗狂犬病毒感染药物中的应用，所述白细胞介素16蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，本发明专利技术解决现有技术中对狂犬病毒感染的治疗效果不佳等问题，高效表达得到的重组大肠杆菌表达的小鼠白介素16在细胞和动物体内能够抑制狂犬病毒的增殖，为保护机体免受狂犬病毒的伤害提供了一种新的途径。受狂犬病毒的伤害提供了一种新的途径。受狂犬病毒的伤害提供了一种新的途径。

【技术实现步骤摘要】
buffer平衡，随后将用0.45μm滤膜过滤后的上清液上样至平衡好的亲和柱，并控制流速为0.5mL/min；上样完毕后用洗涤缓冲液去除杂蛋白；随后用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱，收集得到Mus musculus IL
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16蛋白；6、检测步骤5所得蛋白与狂犬病毒（RABV）的相互作用将IL
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16重组蛋白与RABV
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CVS病毒进行免疫共沉淀得到的复合物用Trizol 法提取其总RNA，以RNA为模板进行RT
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PCR得到cDNA，以逆转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增RABV
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CVS的N、M以及G基因，观察是否扩增出条带。
[0006]7、检测步骤5所得蛋白在细胞上抗狂犬病毒感染的效果；所述小鼠IL
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16蛋白在细胞上抗狂犬病毒感染的应用具体为：IL
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16蛋白与病毒共同孵育组、先加入IL
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16蛋白到细胞中培养2 h后再加病毒孵育组、先用病毒感染细胞2 h后再加入IL
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16蛋白组以及只加入病毒组，比较各组的病毒滴度；8、检测步骤5所得蛋白的动物体内抗狂犬病毒感染的效果；所述小鼠IL
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16蛋白动物体内抗狂犬病毒感染的应用具体为：先通过腹腔或者滴鼻方式对小鼠进行IL
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16蛋白给药，确定该蛋白对小鼠无伤害；然后选取体重约为20g的雄性Balb/c小鼠12只，分为CVS攻毒对照组、PBS组、CVS攻毒24 h后腹腔给药组、CVS攻毒24 h后滴鼻给药组，观察小鼠的生存状况。
[0007]本专利技术的有益效果是：1、本专利技术中采用分子克隆的方法构建质粒，能够保证质粒的正确性；2、本专利技术的方法产量大，可达到200mg/100mL小鼠IL
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16蛋白，且所得蛋白安全可靠具有生物活性，对小鼠无明显的副作用；3、本专利技术高效表达得到的重组大肠杆菌表达的白介素16在细胞和动物体内能够抑制狂犬病毒的增殖，为保护机体免受狂犬病毒的伤害提供了一种新的途径，因此本专利技术为白介素16在狂犬病治疗方面的应用提供了新的方法和思路。
附图说明
[0008]图1为本专利技术所获IL
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16蛋白基因的电泳检测结果图；图2为本专利技术构建质粒的菌液PCR电泳检测结果图；图3为本专利技术IL
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16蛋白纯化的SDS
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PAGE分析结果图；图4为本专利技术所获IL
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16蛋白在细胞上抗狂犬病毒感染的效果图；图5 为本专利技术所获IL
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16蛋白在动物体内抗狂犬病毒感染的效果图；图6 为本专利技术所获IL
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16蛋白与狂犬病毒相互作用验证的免疫PCR结果图。
具体实施方式
[0009]下面通过附图和实施例对本专利技术进一步说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
[0010]实施例1、重组IL
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16蛋白的制备1、IL
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16基因的获取（1）从NCBI数据库中检索Mus musculus IL
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16蛋白的基因编码序列，用primer5设
计IL
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16基因的引物，同时引入EcoRI、XhoI酶切位点(下划线部分)以及它们所对应的保护碱基；引物是在北京硕擎生物科技有限公司合成的，引物序列具体如下：Forward primer：5'
‑ꢀ
CGGAATTCTCCGCAGCCTCAGCTTCAGC
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3'，Reverse primer：5'
‑ꢀ
CCGCTCGAGCTATGAGTCTGCAGAAGCTG
ꢀ‑
3'；（2）用Trizol法提取小鼠脾脏的总RNA，按照天根生物科技有限公司的TRNzol Universal（DP424）试剂的说明书进行操作，提取出来的RNA放到
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80℃冰箱中保存备用；（3）采用康为世纪逆转录试剂盒（CW2569M）对步骤（2）中提取的小鼠脾脏总RNA进行RT
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PCR得到cDNA，实验步骤按试剂盒使用说明进行；（4）步骤（3）中的cDNA用于鼠源IL
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16基因的扩增表1 目的基因扩增体系；PCR反应程序为：95℃变性3 min；其中35个循环包括95℃变性15 s，61℃退火15 s，72℃延伸60 s；最终72℃延伸5 min；16℃终止反应。
[0011]PCR反应结束后，在2% Agarose Gel Electrophoresis上鉴定PCR产物，并根据说明书使用庄盟小容量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（ZP202）切割和回收目标基因大小的条带，结果见图1，从图中可以看出在250～500bp之间出现了一条特异条带，与目的基因IL
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16的理论值357bp一致，序列见SEQ ID NO:1所示。
[0012]2、重组表达载体的构建及转化（1）pET
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28a质粒及基因的双酶切从
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80℃冰箱中取出冻存的转化pET
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28a的大肠杆菌，蘸取少量菌液于LB（卡那霉素）固体培养基上划线，37℃培养14 h；挑取一个单克隆菌落于LB（卡那霉素）液体培养基中培养至对数生长期，取部分菌液使用天根质粒小提试剂盒（DP103）按照说明书上的操作步骤进行质粒的提取。
[0013]将提取出来的pET
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28a质粒和目的基因配制如下表的双酶切反应体系，在37℃下反应5 h进行双酶切；表2 pET
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28a质粒及基因双酶切反应体系
双酶切结束后得到的产物用2% Agarose Gel Electrophoresis鉴定，根据说明书使用庄盟小容量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（ZP202）切割和回收目标基因大小的条带，回收后得到的DNA，用微量分光光度计测定浓度。
[0014]（2）重组表达载体的构建及转化使用T4 DNA Ligase连接双酶切纯化后的载体和目的基因片段，按照下表体系添加试剂，16℃连接反应8 h；表3 IL
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16 蛋白原核表达载体构建体系；将反应结束后得到的连接产物转化至DH5α感受态细胞中，具体步骤为：1）将感受态细胞从
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80℃冰箱取出放冰上20 min；2）将连接产物用移液枪缓慢加入到感受态细胞中混匀，在冰上反应30 min；3）42℃水浴锅中放置60s，轻拿轻放，再与冰上放置2min，加入1mL的LB培养基；4）37℃、200rpm摇菌1h后，使用离心机3000rpm离心5min弃掉900μL上清；5）将剩余的液体吹打混匀后涂布于LB（卡那霉素）固体培养基平板上，在37℃恒温培养箱中倒置培养14 h。
[0015]（3）pET
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28a...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种白细胞介素16蛋白在制备抗狂犬病毒感染药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金阳，黎强，徐瑞贤，宋玉竹，韩芹芹，夏雪山，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：