通过去除叶酸受体蛋白来重新定义家畜奶以减少妊娠和孤独症患者的叶酸受体自身免疫障碍制造技术

本申请提供了重新定义牛奶的系统和方法，以减少种群中叶酸受体自身免疫障碍的流行，进而降低神经管缺陷妊娠、早产、低生育力以及包括孤独症谱系障碍在内的过多发育障碍的发生率。率。率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过去除叶酸受体蛋白来重新定义家畜奶以减少妊娠和孤独症患者的叶酸受体自身免疫障碍


[0001]本专利技术涉及不含叶酸受体(FR)的奶的用途。奶中存在的叶酸受体可以诱导抗人叶酸受体的自身抗体的形成，其可以引起叶酸敏感性异常，诸如出生缺陷(例如，神经管缺陷，即NTD)、不孕症、自发性流产、雄性不育、体外受精失败、神经障碍、神经发育延迟以及神经精神疾病，诸如脑叶酸缺乏或孤独症谱系障碍。本专利技术涉及产生奶(来自牛、山羊和其它用于生产供人类消费的奶的家畜)，其中通过提取去除叶酸受体或从工程化动物中产生叶酸受体，其中沉默或抑制叶酸受体在乳腺中的表达，从而防止生产和分泌至奶中。

技术介绍

[0002]本专利技术一般涉及不含叶酸受体(FRF)的奶和奶制品的生产。暴露于非人奶或含有非人叶酸受体的奶制品可以产生抗人叶酸受体/叶酸结合蛋白(FR/FBP)的自身抗体，其可以阻断叶酸盐或叶酸从母亲转运到胎儿和婴儿大脑中(Rothenberg et al,2004；Ramaekers et al 2005)。
[0003]叶酸对于正常胚胎发育是必需的，因为它参与合成高度增殖的胚胎细胞所需的核酸和氨基酸的一碳代谢(Lucock,Mal.Genet.Metab.71:121(2000))。母体营养已经将叶酸摄入与NTD的预防联系起来(Hibbard and Smithells,Obstet.Gynaecol.Br.Commonwealth 71:529(1964)；Hibbard and Smithells,Lancet l,1254(1965)；Smithall et al.,Arch.Dis.Child 51:944(1976))，并且在妊娠期间补充叶酸是目前的常见做法。然而，许多NTD或其它出生异常的病例发生在未表现出临床叶酸缺乏迹象的母亲中，这促使研究人员去鉴定损害细胞代谢或叶酸摄取的其它原因。虽然已经鉴定了许多遗传原因，但这些基因仅占出生缺陷的一小部分(van der Put et al.,Exp.Biol.Med.(Maywood),226:243(2001))。
[0004]在现有专利公开(US 7,846,672)中，Dr.Edward Quadros描述了叶酸敏感性障碍的发现，诸如不孕症、自发性流产、体外受精失败或出生缺陷，该叶酸敏感性障碍是由于抗叶酸受体的自身抗体干扰了叶酸的摄取。另外，它们描述了检测这些叶酸受体的自身抗体的试验。
[0005]随后的研究表明，超过70％的患有孤独症谱系障碍(ASD)的儿童的FR抗体呈阳性(Frye et al.,Mol.Psych.18:369
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381,(2013))。这些抗体可以阻断叶酸转运至大脑。值得注意的是，我们显示了这些FR抗体与来自牛奶的FR强烈反应(Ramaekers et al.2009)。牛奶含有大量(1
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3ug/ml)叶酸受体α[FR]，其属于涉及叶酸转运的一组叶酸结合蛋白[FBP]。因为人和牛FR在结构上相似，所以分子拟态可能解释了交叉反应性。
[0006]许多报告显示了患有ASD的儿童比未受ASD影响的比较组更可能用奶瓶喂养或提前断奶。这表明提前引入牛或非人哺乳动物奶会增加ASD和相关神经缺陷的风险。在早期发育期间摄入常规牛奶已经涉及促成或引起孤独症和其它神经缺陷。应当相信，这与叶酸代谢的破坏有关，因为叶酸是胎儿和婴儿发育期间必需的营养物。为了引入更多的膳食叶酸，
已经引入了若干“叶酸增强的”奶制品，尽管它们的益处还没有得到证明。
[0007]Dr.Edward Quadros最近发表的工作提供了明确的证据，证明叶酸受体自身抗体普遍存在于诊断为孤独症谱系障碍的儿童、他们正常的兄弟姐妹和父母中(Ramaekers et al.,Mol Psych.18:270
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271(2013)；Frye et al.,Mol Psysch.18:369
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381,(2013))。在患有ASD并且还表达FR自身抗体的儿童中使用高剂量亚叶酸治疗的干预策略已被证明对学习缺陷和行为改善是有益的(Frye et al.,Mol.Psych.23:247
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256,(2018))。正在进行进一步的多中心临床试验。
[0008]尽管高剂量亚叶酸为有认知缺陷和FR抗体的儿童提供了治疗性治疗，但它不能消除引发抗FR的自身抗体形成的损害。在FR抗体阳性的儿童中，不含奶的饮食降低了抗体滴度(Ramaekers et al.2009)，但是该饮食极具限制性并且难以遵守。
[0009]孤独症谱系障碍是影响沟通、社会交往和行为的发育障碍。ASD的症状通常在生命的头两年后是明显的，其特征在于：与他人沟通和交往困难；很少感兴趣和行为重复；伤及人在学校、工作和其它生活领域正常工作的能力的症状。孤独症是一种“谱系”，因为人们经历的症状类型和严重程度有很大的变化。CDC估算在美国，59个个体中就有1个(约1
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2％)受ASD影响。虽然在中国的比率是完全记录的，但估算100个儿童中就有1个可能受到影响(Wang et al.Int J Biol Sci.2018；14(7):717
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725)。在世界的大部分地区，该比率在1/55至1/200之间变化。
[0010]尽管遗传和环境因素已被认为与ASD相关，但还不知道ASD的病因。
[0011]食物过敏在患有ASD的儿童中更普遍，其中11.25％具有过敏症，而在约200,000名儿童的研究中为4.25％。还更频繁地报道了在儿童中的自身免疫状况。新的“脆弱的肠道”假说描述了一些肠道吸收受损的儿童可能如何产生针对其叶酸受体的自身抗体，并且这可能导致ASD的症状。叶酸是胎儿和新生儿神经发育所必需的，最近已在ASD患者中鉴定出了叶酸代谢的破坏。
[0012]图1A示出了正常健壮的肠道。蛋白质和单糖的健康消化发生在小肠中，使营养物容易吸收。纤维和未消化的蛋白质由细菌消耗。血液不与肠腔相互作用，防止了免疫细胞和食物抗原分子之间的任何相互作用。
[0013]图1B示出了脆弱的肠道。患有ASD的儿童表现出消化能力下降。肠道内膜的炎症和恶化阻碍了蛋白质和糖的正常消化。炎症导致血液与肠直接接触，进而允许肠中未消化的蛋白质直接进入血流和/或暴露于GALT(肠相关淋巴组织)和MALT(粘膜相关淋巴组织)。这允许不需要地暴露于免疫组织内的抗原蛋白，以激发免疫应答。
[0014]脆弱的肠道可能会产生针对在牛奶中分泌的牛奶蛋白(包括叶酸受体)(1
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2ug/ml)的自身抗体。从患有ASD的儿童中分离的抗叶酸受体抗体显示出与牛奶中的牛叶酸受体有强烈的交叉反应。当儿童食用不含奶的饮食时，抗体浓度显著降低。不含奶很难遵守。
[0015]叶酸是大脑发育期间的许多过程所需的。图2示出了叶酸代谢，其在ASD患者中通常是异常的。患有ASD的儿童中的70％具有阻断叶酸受体并且阻碍细胞中叶酸摄取的自身抗体(F本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产不含叶酸受体(FRF)的奶的方法，包括：使用选自由以下各项组成的组的方法从奶制品中去除叶酸受体：尺寸排阻色谱、糖基磷脂酰肌醇(GPI)捕获柱亲和色谱、叶酸受体结合抗体亲和柱色谱、使用附着于所述FR结合抗体的蛋白酶的所述叶酸受体的特异性消化、用以去除所述FR的所述奶制品的分馏，或使用特异性结合奶中所述叶酸受体的配体的亲和色谱。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述尺寸排阻色谱包括：使用至少38kDa的膜从奶中过滤所述叶酸受体。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述叶酸受体结合抗体亲和柱色谱包括：产生针对所述叶酸受体的抗体；将所述抗体固定至固体基质中的所述叶酸受体；以及将奶溶液与所述固体基质和针对所述叶酸受体的抗体混合，以从所述奶溶液中选择性去除所述叶酸受体抗原。4.根据权利要求3所述的方法，其中使用附着于所述FR结合抗体的蛋白酶的所述叶酸受体的所述特异性消化包括：将蛋白酶附接至叶酸受体抗体；以及选择性消化奶溶液中的所述叶酸受体。5.根据权利要求4所述的方法，其中使用特异性结合奶中所述叶酸受体的配体的所述亲和色谱包括：在奶溶液中使用叶酸以高亲和力结合所述叶酸受体。6.一种用于降低孤独症比率的不含叶酸受体的奶的系统，包括：在哺乳动物中产生靶向所述叶酸受体的shRNA，进行所述shRNA的核转染，鉴定所述阳性单克隆，以及进行核移植到产生缺乏叶酸受体抗原的奶的哺乳动物中。7.一种在牛成纤维细胞中敲低叶酸受体的方法，包括：鉴定shRNA文库中的shRNA，并且在传感器试验中验证所述shRNA，以发现有效力且特异性地沉默所述叶酸受体的shRNA；证实成纤维细胞中的所述shRNA敲低；克隆含有shRNA或shRNA串联体的载体；以及将所述载体插入到成纤维细胞中。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述载体是乳房特异性启动子
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shRNA或乳房特异性启动子
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shRNA
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shRNA
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shRNA。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述shRNA载体特异性地插入...

【专利技术属性】
技术研发人员：普莱姆，
申请(专利权)人：马里塔乌尔公司，
类型：发明
国别省市：