抗人线粒体外膜蛋白OMP25的单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗人线粒体外膜蛋白OMP25的单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体为HC01

【技术实现步骤摘要】
抗人线粒体外膜蛋白OMP25的单克隆抗体及应用


[0001]本专利技术属于生物技术及免疫学领域，涉及一种抗人线粒体包膜蛋白OMP25单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体为HC01
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R001。

技术介绍

[0002]线粒体是一种存在于真核细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。线粒体形状因生物种类和生理状态而异，一般呈短棒状或圆球状，还可呈环状、线状、哑铃状、分杈状、扁盘状或其它形状。线粒体拥有自身的遗传物质和遗传体系，但其基因组大小有限，是一种半自主细胞器。
[0003]线粒体由外至内可划分为线粒体外膜、线粒体膜间隙、线粒体内膜和线粒体基质四个功能区。线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所。线粒体负责的最终氧化的共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化。除了合成ATP为细胞提供能量等主要功能外，线粒体还承担了许多其他生理功能，例如储存钙离子，参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期、合成胆固醇及某些血红素的能力。
[0004]线粒体结构、形态和功能等的异常与许多疾病的发生发展有关。线粒体在利用氧气制造能量的过程中产生的活性氧自由基会伤害生物体造成氧毒性，是生物体衰老的最原初的原因。人类线粒体出现问题会导致线粒体病，线粒体病是一大类遗传代谢病，主要累计对能量需求较大的组织，包括线粒体肌病、多系统疾病、心肌病、进行性眼外肌麻痹、Leer遗传性视神经病、线粒体肌病、糖尿病、耳聋、共济失调舞蹈病等疾病。近年来，研究发现线粒体与癌细胞转移有关，当肿瘤细胞中线粒体的功能发生改变时就会促进细胞的迁移，最终导致肿瘤成功转移。此外，线粒体介导的线粒体自噬在许多生理和病理过程这发挥了重要作用。
[0005]目前许多研究涉及对线粒体形态和功能的检测，线粒体外膜蛋白特异性抗体在这些研究中有重要的作用，可以用于线粒体分离、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术等检测技术。由于线粒体外膜蛋白具有重要的生物学功能，而且只有部分结构域位于线粒体外侧，因此，选取哪个线粒体外膜蛋白作为靶点不仅影响线粒体分离和检测的效果，而且影响线粒体的功能。线粒体外膜蛋白OMP25结构和功能较为简单，序列特异性高，且在不同物种间保守程度较高，是理想的线粒体外膜识别靶标。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种抗线粒体外膜蛋白OMP25的单克隆抗体，该单克隆抗体为HC01
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R001，其亚型为IgG1、κ型，能与人线粒体外膜蛋白OMP25的膜外区特异性结合；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌HC01
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R001。所述单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；重链编
码核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链编码核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]一种根据所述的单克隆抗体HC01
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R001的制备方法，通过以下步骤获得：(1)小鼠免疫：选择6周龄的雄性BALB/C小鼠，以人线粒体外膜蛋白OMP25全蛋白，对小鼠进行免疫；总共免疫3次，分别为第1、21、35天，每次于小鼠大腿内侧注射100μg抗原加等体积佐剂混合物；第38天处理小鼠，用于融合实验；(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；(3)细胞融合：以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，接种于96孔板，用含20％FCS的HAT培养基培养1天，取步骤(1)中的小鼠脾淋巴细胞，与步骤(2)中的骨髓瘤细胞混合离心，以聚乙二醇(PEG 6000)介导细胞融合，融合后的细胞接种至细胞培养板培养；(4)杂交瘤细胞的筛选：将上述培养细胞在HAT培养基中进行选择性培养，在细胞集落长到一定大小时，吸取上清做抗体鉴定，筛选阳性克隆；(5)杂交瘤细胞克隆化培养：以有限稀释法将阳性克隆稀释到96孔板，使每孔最多只有1个杂交瘤细胞生长，待形成细胞集落后吸取上清做抗体鉴定，将阳性克隆做扩大培养并作抗体理化性状分析；(6)小鼠腹水诱生：接种杂交瘤细胞前1周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷0.5mL/只，然后接种5
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106阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价，并用Protein G亲和柱纯化单克隆抗体。
[0008]本专利技术的另一个目的是提供根据所述的单克隆抗体HC01
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R001的应用，所述应用是单克隆抗体HC01
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R001在进行人线粒体外膜蛋白的ELISA、Western Blotting、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术检测等实验中应用。
[0009]本专利技术的有益效果：HC01
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R001特异性识别线粒体外膜蛋白OMP25，该蛋白结构和功能较为简单，对线粒体影响较小，序列特异性高，且在不同物种间保守程度较高，是理想的线粒体外膜识别靶标。该单克隆抗体用途广泛，可应用于人线粒体外膜蛋白的ELISA、Western Blotting、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术等检测，以及免疫沉淀实验。
附图说明
[0010]图1.单克隆抗体HC01
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R001的纯化。
[0011]图2.单克隆抗体HC01
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R001的免疫球蛋白亚型。
[0012]图3.单克隆抗体HC01
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R001的腹水、培养上清液效价。
[0013]图4.单克隆抗体HC01
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R001 ELISA检测人线粒体外膜蛋白。
[0014]图5.单克隆抗体HC01
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R001流式细胞术检测人线粒体。
[0015]图6.单克隆抗体HC01
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R001免疫荧光检测人线粒体。
[0016]图7.单克隆抗体HC01
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R001 Western Blotting检测人线粒体外膜蛋白。
[0017]图8.单克隆抗体HC01
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R001免疫组化检测人线粒体外膜蛋白。
具体实施方式
[0018]为了进一步理解本专利技术，以下结合附图和实施例，对本专利技术优先实施方案进行描
述，但是应该理解，这些描述只是为进一步说明本专利技术，而不是本专利技术权利要求的限制。
[0019]实施例1抗人线粒体包膜蛋白OMP25单克隆抗体HC01
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R001的制备
[0020](1)抗原准备：选取人线粒体外膜蛋白OMP25全序列，在C末端加入6His标签，插入pet21a载体，以大肠杆菌BL21作为表达宿主细胞，表达OMP25蛋白，并用His标签蛋白纯化蛋白。
[0021](2)小鼠免疫：选择6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗人线粒体外膜蛋白OMP25的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为HC01
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R001，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与人线粒体外膜蛋白OMP25的膜外区特异性结合；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌HC01
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R001，所述单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；重链编码核酸分子核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链编码核酸分子核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体HC01
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R001的制备方法，其特征在于，通过以下步骤获得：(1)小鼠免疫：选择6周龄的雄性BALB/C小鼠，以人线粒体外膜蛋白OMP25全蛋白，对小鼠进行免疫；总共免疫3次，分别为第1、21、35天，每次于小鼠大腿内侧注射100μg抗原加等体积佐剂混合物；第38天处理小鼠，用于融合实验；(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生...

【专利技术属性】
技术研发人员：高传杰，赵明红，
申请(专利权)人：杭州重链科技有限公司，
类型：发明
国别省市：