基于基因编辑技术的作物氮利用效率和籽粒产量协同改良方法技术

本发明专利技术公开了一种基于基因编辑技术的作物氮利用效率和籽粒产量协同改良方法，降低和/或敲除SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3所示基因或其同源基因/等效基因在作物中的表达，使得作物的籽粒重量、穗粒数、籽粒蛋白含量同时获得提升。本发明专利技术通过基因组定点编辑技术同时突变了小麦TaAAP3基因的三个位点，所得到的纯合株显著增加了籽粒大小、穗粒数、籽粒氨基酸含量，提高了籽粒产量和氮利用效率。利用效率。利用效率。

【技术实现步骤摘要】
基于基因编辑技术的作物氮利用效率和籽粒产量协同改良方法


[0001]本专利技术涉及基因工程和作物育种
，尤其涉及提高小麦氮肥利用效率和产量的基因及其应用。

技术介绍

[0002]小麦(Triticuma estivum L.)是世界三大主粮之一，提高小麦的生产能力对于保障全球粮食安全至关重要。随着世界人口的增加和可耕种土地面积的减少，提高作物的产量一直是作物育种改良的重要目标。农业实践中粮食不断增产的主要推动力是化肥的大量施用，其中绝大部分是氮肥。然而，化肥的过量施用，不仅会对空气、土壤和水体造成污染等负面影响，也给农业可持续发展带来了巨大的环保压力。当前，我国小麦的氮肥利用效率还不足40％。要满足当前人口对粮食的需求，需要大量的氮肥投入。因此，在保证小麦产量持续增加的同时，如何提高小麦的氮肥利用效率，减少氮肥的使用量是小麦育种与产业发展必须考虑的因素，以利于解决小麦产量提升与生态环境冲突的问题。
[0003]小麦主要通过根系吸收土壤中的无机氮(包括硝酸盐、铵盐)和有机氮(包括氨基酸、多肽等)来维持植物正常的生长发育。针对不同的氮源，植物已经进化出多种高效的氮吸收和运输系统，以支持其在不同氮形态和氮水平的环境中生长和发育。近年来，植物对无机氮的吸收和转运利用已有很多深入的研究进展。在水稻无机氮转运蛋白家族中，NPF(硝酸盐转运蛋白1[NRT1]/肽转运蛋白[PTR]家族)成员的功能已被广泛研究。OsPTR9(OsNPF8.20；Fang et al.，2013)、 NRT1.1B(OsNPF6.5；Hu et al.2015)、OsNPF7.2(Wang et al.2018)和OsNPF7.7 (Huang et al.2018)可以通过调节N含量来影响水稻分蘖数。
[0004]植物体内氮的运输和分配主要以氨基酸的形式进行(Xu et al.2012)。氨基酸是植物代谢的重要组成部分，不仅作为蛋白质的组成，而且是重要的次级代谢物前体和植物器官之间有机氮的载体(Dinkeloo et al.，2018；Tegeder，2012； Jin et al.2019)。氨基酸转运蛋白在氨基酸的跨膜转运中发挥着重要作用，直接或间接参与了对植物生长发育至关重要的氮代谢过程。这些过程包括细胞内氨基酸的同化和分配，氨基酸的短距离和长距离转运，以及库器官对氨基酸的吸收和利用(Tegeder，2014；Tegeder andMasclaux
‑
Daubresse，2018)。
[0005]目前针对小麦的对应记基因研究报道很少，其对氨基酸的转运特性、以及对小麦产量和氮利用效率目前没有任何研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是提供一种基于基因编辑技术的作物氮利用效率和籽粒产量协同改良方法。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案如下。
[0008]一种作物氮利用效率和籽粒产量协同改良方法，降低和/或敲除SEQ ID NO： 1和/
或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3所示基因或其同源基因/等效基因在作物中的表达，使得作物的籽粒重量、穗粒数、籽粒蛋白含量同时获得提升。
[0009]作为本专利技术的一种优选技术方案，同时降低/敲除SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3所示基因或其同源基因/等效基因在作物中的表达，使得作物的籽粒重量、穗粒数、籽粒蛋白含量同时获得提升。
[0010]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述作物为禾本科作物。
[0011]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述作物为小麦。
[0012]作为本专利技术的一种优选技术方案，该方法包括如下步骤：
[0013]A、定位和命名：首先将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3 所示基因依次分别命名为TaAAP3
‑
7A、TaAAP3
‑
7B和TaAAP3
‑
7D，所述三组基因依次分布在小麦基因组7A、基因组7B和基因组7D上；
[0014]B、靶点设计：对小麦中A、B、D基因组中TaAAP3核苷酸序列进行分析获取最佳靶点；
[0015]C、sgRNA序列设计：基于CRISPR
‑
GE分析工具，设计出基因编辑的靶位点序列构建sgRNA序列；
[0016]D、连接：将sgRNA序列连接到pTaU6
‑
sgRNA载体上，将Cas9基因连接在PJIT163载体上；
[0017]E、表达：连接完成后，用组成型启动子玉米Ubiquitin启动子驱动表达；
[0018]F、转化：采用基因枪介导的转化方法，将分别含有Cas9和sgRNA的两个线性最小表达框转化小麦愈伤组织，得到转化植株。
[0019]作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤B中，以TaAAP3
‑
7A、TaAAP3
‑
7B 和TaAAP3
‑
7D的第五个外显子为靶点。
[0020]作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤C中，所述sgRNA序列为： CGTGTACGAC TCCATGTACATGG，末尾三个序列为PAW序列。
[0021]作为本专利技术的一种优选技术方案，步骤F之后还包括如下后续步骤：G、检测：经A、B、D基因组特异引物PCR
‑
RE检测和测序进行转基因株系突变体类型分析，筛选到A、B、D基因组均突变的非转基因纯合的TaAAP3基因编辑敲除突变体。
[0022]采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本专利技术通过抑制小麦中TaAAP3 蛋白的表达和/或活性，提高了小麦产量和氮利用效率提高，创制了具有较大千粒重和较高蛋白质含量的小麦种质和品种，丰富了小麦高产和氮高效的材料。具体的，本专利技术通过基因组定点编辑技术同时突变了小麦TaAAP3基因的三个位点，即同时敲除了TaAAP3
‑
7A、TaAAP3
‑
7B基因和TaAAP3
‑
7D基因，所得到的纯合株显著增加了籽粒大小、穗粒数、籽粒氨基酸含量，提高了籽粒产量和氮利用效率。
附图说明
[0023]图1显示TaAAP3
‑
7A基因、TaAAP3
‑
7B基因和TaAAP3
‑
7D基因的位点分布。
[0024]图2为原生质体瞬时转化验证sgRAN活性的PCR酶切图和测序结果；图中， 1：转化后的原生质体；2：野生型对照；3：野生型突变体；4：DNAMarker。
[0025]图3为T0代转基因植株进行PCR酶切的结果。
[0026]图4为不同供氮水平下T2代TaAAP3基因敲除突变体小麦籽粒大小性状表型。
[0027]图5为不同供氮水平下T2代TaAAP3基因敲除突变体小麦籽粒产量性状表型。
[0028]图6为不同供氮水平本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种作物氮利用效率和籽粒产量协同改良方法，其特征在于：降低和/或敲除SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3所示基因或其同源基因/等效基因在作物中的表达，使得作物的籽粒重量、穗粒数、籽粒蛋白含量同时获得提升。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：同时降低/敲除SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示基因或其同源基因/等效基因在作物中的表达，使得作物的籽粒重量、穗粒数、籽粒蛋白含量同时获得提升。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述作物为禾本科作物。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述作物为小麦。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：A、定位和命名：首先将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示基因依次分别命名为TaAAP3
‑
7A、TaAAP3
‑
7B和TaAAP3
‑
7D，所述三组基因依次分布在小麦基因组7A、基因组7B和基因组7D上；B、靶点设计：对小麦中A、B、D基因组中TaAAP3核苷酸序列进行分析获取最佳靶点；C、sgRNA序列设计：基于CRIS...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡梦芸，张颖君，滕婉，孙丽静，赵杰，李倩影，王培楠，童依平，李辉，
申请(专利权)人：河北省农林科学院粮油作物研究所，
类型：发明
国别省市：