一种快速获得萝卜转基因材料的方法技术

本发明专利技术涉及一种快速获得萝卜转基因材料的方法，包括：对萝卜种子进行消毒种植无菌苗；活化携带目的基因的发根农杆菌；制备侵染液；获取无根苗外植体并浸入菌液进行侵染；经过共培养和脱菌培养30d后，通过表型筛选、PCR检测和qRT

【技术实现步骤摘要】
一种快速获得萝卜转基因材料的方法


[0001]本专利技术属于萝卜转基因体系
，涉及发根农杆菌介导的萝卜遗传转化体系的建立方法，以及以转基因毛状根为外植体获得转基因愈伤组织方法的优化。

技术介绍

[0002]萝卜(Raphanus sativus L.)为十字花科萝卜属一、二年生草本植物，营养丰富，食疗保健价值高，在我国蔬菜生产和周年供应中占有重要地位。目前，随着萝卜基因组序列的公布以及转基因工程等现代生物技术的快速发展，给萝卜种质遗传改良提供了新的思路和选择。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)可通过Ri质粒诱导植物产生生理性状和遗传性稳定的毛状根，同时将外源基因共同整合到植物基因组中，从而实现目的基因的遗传转化。发根农杆菌介导的遗传转化具有周期短、操作简单和应用范围广等优点，已成为植物基因功能验证和根系生物学研究的有力工具。然而，目前尚未见对发根农杆菌介导萝卜遗传转化的影响因素进行综合分析的研究报道，没有建立高效的转化体系。通过发根农杆菌诱导萝卜产生不定根，提高了转化的效率，能够进行部分基因功能在萝卜本体中的验证。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一种快速获得萝卜转基因毛状根和以毛状根为外植体诱导转基因愈伤组织的体系，为萝卜基因功能的验证提供了有效方法。与其他的瞬时转化和异源转化相比，发根农杆菌介导的遗传转化体系更便捷、稳定。
[0004]本专利技术的具体技术方案如下：
[0005]一种快速获得萝卜转基因材料的方法，包括以下步骤：
[0006](1)对萝卜种子进行消毒，将消毒后的种子播种到灭菌的MS培养基上获得无菌苗。
[0007](2)活化携带目的基因的发根农杆菌。
[0008](3)侵染无菌苗的前一天使用LB液体培养基摇菌。
[0009](4)待无菌苗生长到6
‑
7d时，切除实生根获得无根苗，使用步骤(3)中的菌液侵染无根苗。
[0010](5)侵染后的植株在无菌滤纸上晾干，随后接种到MS培养基上共培养2d。
[0011](6)共培养结束后，将植株转移到脱菌培养基上进行培养。
[0012](7)培养30d后，对发出的毛状根进行表型鉴定，提取DNA和RNA进行PCR检测和qRT
‑
PCR分析，检测目的基因是否成功转入毛状根并过量表达。
[0013](8)以转基因毛状根为外植体诱导转基因愈伤组织。
[0014]所述的发根农杆菌为MSU440菌株，属于农杆碱型发根农杆菌。
[0015]步骤(1)中，采用75％的乙醇消毒1.5min，8％的次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗3次，在无菌滤纸上晾干，完成种子灭菌过程。
[0016]步骤(2)中，携带目的基因的发根农杆菌菌液保存在
‑
80℃冰箱中，使用LB固体培养基进行活化；
[0017]所述的LB固体培养基为：在每升的LB培养基中添加100mg/L卡那霉素(Kan)+50mg/L链霉素(Str)+15g/L琼脂。
[0018]步骤(2)中，使用灭菌枪头吸取20μL菌液，在LB固体培养基上划线后密封，倒置于28℃恒温培养箱培养2d，待菌落长出。
[0019]步骤(3)中，使用灭菌枪头刮取菌落转移到LB液体培养基中，于28℃，220rmp恒温摇床培养8
‑
12h。
[0020]所述的LB液体培养基为：LB液体培养基+100mg/L Kan+50mg/L Str。
[0021]步骤(4)中，侵染时使用的菌液OD
600
值为1.0；
[0022]步骤(4)中，侵染时间为10min；
[0023]步骤(4)中，菌液中添加300μmol/L的乙酰丁香酮(AS)。
[0024]步骤(5)中，侵染后的外植体放在无菌滤纸上，使用滤纸吸干植株表面菌液，伤口处向下，竖直插入培养基中，确保伤口完全接触培养基。
[0025]步骤(6)中，脱菌培养基为：MS培养基+300mg/L头孢噻肟霉素(Cef)，脱菌培养过程中不需要更换培养基。
[0026]步骤(7)中，通过表型观察，初步鉴定转基因毛状根；
[0027]步骤(7)中，采用CTAB法提取DNA；
[0028]步骤(7)中，PCR扩增反应体系为：总体积为10μL，其中Taq酶Mix 5μL、引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.5μL、模板DNA(20ng/μL)1μL、ddH2O 3μL。
[0029]PCR反应程序：
[0030][0031]qRT
‑
PCR反应体系为：体系为15μL，其中，2
×
SYBR green reaction mix 7μL，引物F(10μM)和引物R(10μM)各0.56μL，cDNA(20ng/μL)，ddH2O 3μL。
[0032]qRT
‑
PCR反应程序：
[0033][0034]步骤(8)中，诱导愈伤组织的毛状根切成0.5cm的切断；
[0035]步骤(8)中，诱导愈伤组织的培养基为：MS+0.75mg/L噻二唑苯基脲(TDZ)+0.5mg/L萘乙酸(NAA)+300mg/L Cef。
[0036]步骤(8)中，诱导愈伤组织的时长为21d。
[0037]本专利技术的有益成果：
[0038]本专利技术以萝卜品种
‘
NAU
‑
LHZ
’
的无根苗为外植体材料，建立了发根农杆菌介导的萝卜遗传转化体系，并且以转基因毛状根为外植体成功诱导出转基因愈伤组织。不仅克服了传统转基因体系周期长、转化效率低的问题，还为萝卜本体基因功能的验证提供了有效手段。与瞬时转化相比，该转化系统更稳定、可靠性更高，为萝卜基因功能的验证以及转基因植株的培育提供了一种新方法。
附图说明
[0039]附图1侵染7d和30d后不同外植体毛状根的诱导情况(A：7d下胚轴；B：7d生长点；C：7d带柄子叶；D：7d无根苗；E：30d下胚轴；F：30d生长点；G：30d带柄子叶；H：30d无根苗)；
[0040]附图2不同侵染时间毛状根的诱导情况(A：侵染5min；B：侵染10min；C：侵染15min)；
[0041]附图3不同苗龄毛状根的诱导情况(A：3
‑
4d苗龄；B：6
‑
7d苗龄；C：9
‑
10d苗龄)；
[0042]附图4为实施例1中诱导获得的转基因红色表型毛状根；
[0043]附图5为实施例1中转基因红色毛状根为外植体诱导产生的红色愈伤组织；
[0044]附图6为实施例1中转基因红色毛状根PCR检测图(M：2000Marker；CK：转pCAMBIA1300空载的白色毛状根；RsMYB90：红色表型转基因毛状根)；
[0045]附图7为实施例1中RsMYB90本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对萝卜种子进行消毒，接种到MS培养基上，获得无菌苗；(2)携带目的基因的发根农杆菌菌液活化与侵染液制备；(3)外植体制备与侵染；(4)共培养、脱菌培养及毛状根诱导；(5)根据表型或载体荧光标记筛选转基因毛状根；(6)DNA、RNA提取和反转录，PCR检测和qRT
‑
PCR分析；(7)将转基因毛状根切成0.5em的小段接种至愈伤组织培养基上诱导转基因愈伤组织。2.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(1)中，消毒方式为采用75％的酒精消毒1.5min，8％次氯酸钠消毒10min，随后用无菌水冲洗3次；MS培养基成分为：41.74g/L MS(含琼脂(Agar)和蔗糖(Sucrose))；无菌苗于25℃，光照时长为16h/d的条件下培养。3.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(2)中含有目的基因的发根农杆菌菌液保存在
‑
80℃冰箱中，活化农杆菌的培养基为：20g/L LB+15g/L琼脂+100mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan)+50mg/L链霉素(Streptomycin sulfate，Str)；摇菌时培养基为：20g/L LB+100mg/L Kan+50mg/L Str；侵染液制备时，采用1/2MS液体培养基，将菌液OD
600
值调节至1.0，菌液中添加300μmol/L的乙酰丁香酮(AS)，侵染过程在28℃，220rmp摇床中进行；1/2MS液体培养基的成分为4.6g/L 1/2MS+30g/L蔗糖。4.如权利要求1所述的一种快速获得萝卜转基因材料的方法，其特征在于：步骤(3)中取6
‑
7d苗龄无菌苗，从生长点向下1c...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燕，王爽，易小芳，应佳丽，董俊辉，柳李旺，徐良，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：