一种重组蛋白质微球及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提出了一种重组蛋白质微球及其制备方法和应用，属于生物诊断技术领域，包括：S1.将结核分枝杆菌接种于TSB培养基中培养，离心，洗涤，加入蛋白酶抑制剂，超声，离心，得到菌体蛋白，与琼脂糖凝胶混合，孵育，洗涤，洗脱，得到结核分枝杆菌Rv1886c蛋白；S2.将结核分枝杆菌Rv1886c蛋白溶于水中，得到水相；S3.将PLGA、表面活性剂溶于有机溶剂中，得到油相；S4.将水相和油相混合后，加入PVA溶液，乳化，反应，离心，洗涤，干燥，得到重组蛋白质微球。本发明专利技术制得的重组蛋白质微球性能好、成囊成膜性强、制备方便，可以灵敏的用于制备结核病诊断或鉴定的药物及产品中，灵敏度高，特异性好，准确度高。高。高。

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白质微球及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物诊断
，具体涉及一种重组蛋白质微球及其制备方法 和应用。

技术介绍

[0002]结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tb)感染所致的一种慢性传染病，是由单一致病菌感染引起的 死亡率最高的疾病。
[0003]目前，用于TB诊断的方法有X光检查、病原学检测(F液抗酸染色法及细 菌培养法)、结核菌素(purifiedprotein derivative，PPD)皮肤试验及TB核酸序 列扩增技术等，病原学检测是TB诊断的金标准，我国的M.tb病原学诊断率较低， 2020年WHO报告显示，我国TB病原学阳性率为47％，低于全世界57％的检 出率，仅靠此法会延误对患者的治疗；PPD皮试是一种免疫学检测方法，具有操 作简单的优势，但难以区分卡介苗的免疫效果及致病性M.tb的感染，因此诊断 价值不高；在TB早期诊断中，核酸扩增技术是病原学诊断的重要补充，但因其 成本高及对检测环境的严格要求，限制了其在基层医院的应用，血清学检测具有 操作简便、灵敏度高、适用于肺外结核和肺结核等优势，因此，获得高灵敏度、 高特异性的M.tb抗原或抗体，并将其应用于血清学检测TB，是早期诊断TB的 理想方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提出一种重组蛋白质微球及其制备方法和应用，具有性能 较好、成囊成膜性强、制备方便等优点，制得的重组蛋白质微球可以灵敏的用于 制备结核病诊断或鉴定的药物及产品中，灵敏度高，特异性好，准确度高。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]本专利技术提供一种重组蛋白质微球的制备方法，包括以下步骤：
[0007]S1.结核分枝杆菌Rv1886c蛋白的提取：将结核分枝杆菌接种于TSB培养基 中培养，离心，洗涤，加入蛋白酶抑制剂，超声，离心，得到菌体蛋白，将菌体 蛋白和琼脂糖凝胶混合，孵育，洗涤，洗脱，得到结核分枝杆菌Rv1886c蛋白；
[0008]S2.水相的制备：将步骤S1制得的结核分枝杆菌Rv1886c蛋白溶于水中，得 到水相；
[0009]S3.油相的制备：将PLGA、表面活性剂溶于有机溶剂中，得到油相；
[0010]S4.重组蛋白质微球的制备：将步骤S2中的水相和步骤S3中的油相混合后， 加入PVA溶液，乳化，搅拌反应，离心，洗涤固体，干燥，得到重组蛋白质微 球。
[0011]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1的具体步骤为：将结核分枝杆菌接种于 含5
‑
10％小牛血清TSB培养基中，35
‑
40℃培养40
‑
50h，3000
‑
5000r/min离心 10
‑
15min，用pH＝7.5
‑
8.5的0.01
‑
0.05mol/L的Tris
‑
HCl洗涤2
‑
3次，加入蛋白酶 抑制剂，300
‑
500W超声裂解10
‑
15min，7000
‑
12000r/min离心20
‑
30min，过滤， 得到菌体蛋白，将菌体蛋白和琼脂糖凝胶混合，0
‑
10℃孵育1
‑
3h，用pH＝7.5
‑
8.5 的0.01
‑
0.05mol/L的Tris
‑
HCl洗涤2
‑
3次，用含
0.2
‑
0.5mol/LNaCl的pH＝7.5
‑
8.5 的0.01
‑
0.05mol/L的Tris
‑
HCl洗涤2
‑
3次洗脱，得到结核分枝杆菌Rv1886c蛋白。
[0012]作为本专利技术的进一步改进，所述蛋白酶抑制剂选自亮肽素、抗痛素、糜蛋白 酶抑素、抑弹性蛋白酶醛、抑胃蛋白酶素、磷酰胺素中的至少一种，添加量为体 系总质量的1
‑
3wt％。
[0013]作为本专利技术的进一步改进，所述菌体蛋白和琼脂糖凝胶的质量比为(2
‑
5)： 10。
[0014]作为本专利技术的进一步改进，步骤S2中所述水相中结核分枝杆菌Rv1886c蛋 白的含量为3
‑
5wt％。
[0015]作为本专利技术的进一步改进，步骤S3中所述表面活性剂选自失水山梨醇单油 酸酯、二异丁基酚聚氧乙烯醚、脱氢松香胺聚氧乙烯醚、司盘
‑
80中的至少一种； 所述油相中所述PLGA的含量为5
‑
12wt％；所述油相中所述表面活性剂的含量为 1
‑
2wt％。
[0016]作为本专利技术的进一步改进，步骤S4中所述PVA溶液的含量为3
‑
5wt％；所 述水相、油相、PVA溶液的质量比为(3
‑
5)：7：(1
‑
2)。
[0017]作为本专利技术的进一步改进，步骤S4中所述乳化条件为10000
‑
12000r/min转 速下乳化3
‑
7min；所述离心条件为3000
‑
5000r/min转速下离心10
‑
15min；所述干 燥温度为20
‑
40℃，时间为2
‑
4h。
[0018]本专利技术进一步保护一种上述的制备方法制得的重组蛋白质微球。
[0019]本专利技术进一步保护一种上述重组蛋白质微球在制备结核病诊断或鉴定的药 物及产品中的应用。
[0020]本专利技术具有如下有益效果：本专利技术通过分离得到结核分枝杆菌Rv1886c蛋 白，溶于水中得到水相，加入含有PLGA的油相中，加入PVA溶于，乳化得到 油包水液滴，固化干燥后得到重组蛋白质微球，该微球以重组蛋白质微球乳酸羟 基乙酸聚合物(PLGA)为壳材，PLGA由乳酸与羟基乙酸的单体聚合而成的一种可 降解的高分子有机化合物，是一种安全性高，生物相容性好的药物载体，具有性 能较好、成囊成膜性强、制备方便等优点，制得的重组蛋白质微球可以灵敏的用 于制备结核病诊断或鉴定的药物及产品中，灵敏度高，特异性好，准确度高。
附图说明
[0021]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例 或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的 附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造 性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0022]图1为本专利技术实施例1制得的重组蛋白质微球的SEM图；
[0023]图2为本专利技术实施例5中间接ELISA法测定重组蛋白质微球抗体滴度图。
具体实施方式
[0024]下面将对本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白质微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.结核分枝杆菌Rv1886c蛋白的提取：将结核分枝杆菌接种于TSB培养基中培养，离心，洗涤，加入蛋白酶抑制剂，超声，离心，得到菌体蛋白，将菌体蛋白和琼脂糖凝胶混合，孵育，洗涤，洗脱，得到结核分枝杆菌Rv1886c蛋白；S2.水相的制备：将步骤S1制得的结核分枝杆菌Rv1886c蛋白溶于水中，得到水相；S3.油相的制备：将PLGA、表面活性剂溶于有机溶剂中，得到油相；S4.重组蛋白质微球的制备：将步骤S2中的水相和步骤S3中的油相混合后，加入PVA溶液，乳化，搅拌反应，离心，洗涤固体，干燥，得到重组蛋白质微球。2.根据权利要求1所述重组蛋白质微球的制备方法，其特征在于，步骤S1的具体步骤为：将结核分枝杆菌接种于含5
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10％小牛血清TSB培养基中，35
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40℃培养40
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50h，3000
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5000r/min离心10
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15min，用pH＝7.5
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8.5的0.01
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0.05mol/L的Tris
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HCl洗涤2
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3次，加入蛋白酶抑制剂，300
‑
500W超声裂解10
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15min，7000
‑
12000r/min离心20
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30min，过滤，得到菌体蛋白，将菌体蛋白和琼脂糖凝胶混合，0
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10℃孵育1
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3h，用pH＝7.5
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8.5的0.01
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0.05mol/L的Tris
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HCl洗涤2
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3次，用含0.2
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0.5mol/LNaCl的pH＝7.5
‑
8.5的0.01
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0.05mol/L的Tri...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐欣，崔晗，闫平平，毕孝瑞，
申请(专利权)人：齐欣，
类型：发明
国别省市：