检测植物内、外源基因的分子标记、引物组和方法技术

本发明专利技术涉及植物分子遗传育种技术领域，具体涉及检测植物内、外源基因的分子标记、引物组和方法。本发明专利技术提供用于检测植物内、外源CYP704B2基因的引物组，该引物组包括外源转基因检测引物组和内源基因检测引物组；所述外源转基因检测引物组包括具有如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
检测植物内、外源基因的分子标记、引物组和方法


[0001]本专利技术涉及植物分子遗传育种
，具体涉及检测植物内、外源基因的分子标记、引物组和方法。

技术介绍

[0002]转基因检测大致分为基于转基因植物的核酸水平检测和蛋白水平检测两类(Querci M,Van den Bulcke M(2010)New approaches in GMO detection.Anal Bioanal Chem 396(6):1991
‑
2002)。其中，基于核酸水平的检测具有检测方便、可检测范围广等特点，因此使用较为广泛(Elenis D,Kalogianni D(2008)Advances in molecular techniques for the detection and quantification of genetically modified organisms.Anal Bioanal Chem 392(3):347
‑
54)。基于核酸水平的检测方法按具体应用又可以分为以下几种：1、传统定性PCR检测技术；2、荧光定量PCR检测技术；3、多重PCR检测技术；4、核酸杂交检测技术；5、基因芯片检测技术等。
[0003]专利申请CN102154446A公开了一种利用real
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time PCR技术，对内、外源基因序列具有SNP差异的转基因植株及其后代进行检测的方法。该方法需要使用基因特异性探针，存在成本较高的问题。专利申请CN111593135A公开了一种鉴别转基因材料及其自交、杂交、回交后代中内、外源基因的检测引物和方法，该方法需要在常规PCR后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳以区分内、外源基因和内源基因的基因型，耗时较长且难以实现高通量检测。
[0004]因此，开发一种高通量、低成本、简单快捷以及低错误率的植物内、外源基因检测方法，可大幅度提高分子辅助育种、性状基因的精细定位以及种质资源鉴定的效率。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种检测植物内、外源基因的分子标记、引物组和方法。
[0006]KASP(竞争性等位基因PCR)技术可通过对一段含有SNP位点的基因序列设计不同引物来进行SNP分型，本专利技术基于KASP技术利用修饰过的外源基因与内源基因的SNP位点的差异设计引物，将其用于转基因植物的筛选和基因型检测中。本专利技术经大量筛选获得了基于KASP技术的两个引物组，这两个引物组可准确区分外源CYP704B2基因(转基因成分)以及内源野生型CYP704B2基因和突变型CYP704B2基因，用于检测待测植株的内源CYP704B2基因基因型以及是否含有外源转基因成分，有效提高了筛选获得不同目标基因型组合的效率。
[0007]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]第一方面，本专利技术提供检测植物内、外源CYP704B2基因的分子标记，所述分子标记包括外源转基因分子标记K
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1和内源基因分子标记K
‑
2；
[0009]其中，所述分子标记K
‑
1由核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
3所示的引物扩增得到；所述分子标记K
‑
2由核苷酸序列如SEQ ID NO.4
‑
6所示的引物扩增得到。
[0010]本专利技术中，内源CYP704B2基因是指野生型CYP704B2基因和/或突变的CYP704B2基
因，其中，突变的CYP704B2基因为相对于野生型CYP704B2基因，编码区第794位碱基后GGG被替换为T(1907突变型)；对于水稻而言，野生型CYP704B2基因是指水稻日本晴或9311基因组中的CYP704B2基因。
[0011]本专利技术中，外源CYP704B2基因是指转入水稻中能够恢复其育性的CYP704B2基因，为区分基因组内源CYP704B2基因与外源转基因的CYP704B2基因，本专利技术在CYP704B2基因的第839位引入了A/C的SNP位点，该突变为同义突变，不会导致氨基酸序列的改变，以此作为外源CYP704B2基因(修饰的CYP704B2基因)。
[0012]第二方面，本专利技术提供用于检测植物内、外源CYP704B2基因的引物组，所述引物组包括外源转基因检测引物组和内源基因检测引物组；
[0013]所述外源转基因检测引物组包括具有如SEQ ID NO.1
‑
3所示的核苷酸序列的引物；所述内源基因检测引物组包括具有如SEQ ID NO.4
‑
6所示的核苷酸序列的引物。
[0014]上述外源转基因检测引物组中各引物的序列具体如下：
[0015]SEQ ID NO.1：ATGATGTTGGCAGCGTCGAAT；
[0016]SEQ ID NO.2：ATGATGTTGGCAGCGTCGAAG；
[0017]SEQ ID NO.3：GGTTTGGGGTTGAGATCGGG。
[0018]其中，SEQ ID NO.3所示引物为公共引物，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物分别针对CYP704B2基因第794位的SNP位点G/T。
[0019]上述内源基因检测引物组中各引物的序列具体如下：
[0020]SEQ ID NO.4：TCGGGTTTGGGGTTGAGATCG；
[0021]SEQ ID NO.5：TCGGGTTTGGGGTTGAGATCT；
[0022]SEQ ID NO.6：ATGATGTTGGCAGCGTCGAAT；
[0023]其中，SEQ ID NO.6所示引物为公共引物，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示引物分别针对CYP704B2基因第839位SNP位点A/C。
[0024]上述引物组为基于KASP技术设计，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物与具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的引物的5
’
端分别被荧光基团标记，且两条引物标记的荧光基团是不同的；具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的引物与具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物的5
’
端分别被荧光基团标记，且两条引物标记的荧光基团是不同的。
[0025]引物组中引物的荧光基团修饰，只需满足上述原则即可，两组引物之间的荧光基因是否相同不做特殊限制。在满足上述原则的基础上，荧光基团可在已知的荧光基团中任意选择，例如：FAM、VIC、HEX、Texas Red、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA等。
[0026]在本专利技术的一些实施方式中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物的5
’
端标记FAM，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物的5
’
端标记VIC。核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物的5
’
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测植物内、外源CYP704B2基因的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括外源转基因分子标记K
‑
1和内源基因分子标记K
‑
2；所述分子标记K
‑
1由核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
3所示的引物扩增得到；所述分子标记K
‑
2由核苷酸序列如SEQ ID NO.4
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6所示的引物扩增得到。2.用于检测植物内、外源CYP704B2基因的引物组，其特征在于，所述引物组包括外源转基因检测引物组和内源基因检测引物组；所述外源转基因检测引物组包括具有如SEQ ID NO.1
‑
3所示的核苷酸序列的引物；所述内源基因检测引物组包括具有如SEQ ID NO.4
‑
6所示的核苷酸序列的引物。3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物与具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的引物的5
’
端分别被荧光基团标记，且两条引物标记的荧光基团是不同的；具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的引物与具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物的5
’
端分别被荧光基团标记，且两条引物标记的荧光基团是不同的。4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2或3所述的引物组；优选地，所述试剂盒还包含选自用于KASP反应的缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、Mg
2+
、荧光染料、淬灭基团中的一种或多种。5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在植物育种或种质资源改良中的应用。6.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在检测植物所含CYP704B2基因的基因型或预测植物花粉育性中的应用。7.权利要求1所述的分子标记或权利要求2或3所述的引物组或权利要求4所述的试剂盒在检测植物是否含有转基因成分或转基因产品检测中的应用；所述转基因成分为修饰的CYP704B2基因，所述修饰的CYP704B2基因与野生型CYP704B2基因相比，含有第839位A突变为C的突变。8.根据权利要求5～7任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为水稻、玉米、大豆、小麦、大麦、小米或高粱。9.一种检测水稻内、外源CYP704B2基因的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测水稻的DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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3所示的引物组和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.4
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6所示的引物组进行KASP反应，得到PCR产物，检测PCR产物的荧光信号，根据荧光信号的类型判断待测水稻所含内、外源CYP704B2基因的基因型；其中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物与核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物的5
’
端分别被荧光基团标记，且两条引物标记的荧光基团是不同的；核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物与核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物的5
’
端分别被荧光基团标记，且两条引物标记的荧光基团是不同的。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述根据荧光信号的类型判断待测水稻所含内、外源CYP704B2基因的基因型为：采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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3所示的引物组检测水稻是否含有外源CYP704B2基因转基因成分及其基因型，若只检测到SEQ ID NO.2所示引物所含荧光基团对应的荧光信号，则判断待测水稻含有转基因成分，基因型为msmsT，花粉育性为一半可育一半不育；若只检
测到SEQ ID NO.1所示引物所含荧光基团对应的荧光信号，则判断待测水稻不含有转基因成分，基因型为MsMs或Msms，花粉育性为完全可育；若同时检测到SEQ ID NO.1和2所示引物所含荧光基团对应的荧光信号，则判断待测水稻含有转基因成分，基因型为MsMsT或...

【专利技术属性】
技术研发人员：李燕群，李佳林，刘功朋，郑秋菊，庄礼捷，李新鹏，曾翔，吴永忠，
申请(专利权)人：海南波莲水稻基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：