一种可放大的可拉酸纯化方法技术

本发明专利技术适用于可拉酸纯化生产领域，提供了一种可放大的可拉酸纯化方法，所述的纯化方法包括：将CaCl2加入到可拉酸发酵液中进行固液分离预处理；滤液进行聚合物反相层析，得流穿液A；流穿液A进行复合填料串联层析，得流穿液B；流穿液B进行超滤浓缩换液，得溶液C；溶液C进行醇沉、脱水、真空干燥，得到成品。本发明专利技术提供的透明质酸发酵液分离纯化方法为清洁生产工艺，不使用活性炭，无添加任何毒害物质，超滤浓缩后最小量的乙醇加入，生产的成品因此更加安全、环保。本发明专利技术采用流穿的层析模式能够大规模、高效率的制备1000万道尔顿以上的可拉酸。本发明专利技术制备所得的产品蛋白残留＜0.1%、核酸残留A260＜0.1（2g/L）、重金属残留＜10ppm及内毒素符合药用级要求。素符合药用级要求。素符合药用级要求。

【技术实现步骤摘要】
一种可放大的可拉酸纯化方法


[0001]本专利技术属于可拉酸生产纯化领域，尤其涉及一种可放大的高分子量可拉酸纯化方法。

技术介绍

[0002]微生物胞外多糖是细菌、真菌、蓝藻等微生物在代谢过程中产生的对微生物有保护作用的生物高聚物。在自然条件下，多数细菌被多糖包被。包被于细菌表面的多糖对于细菌在竞争环境中的存活和生长都有重要作用。可拉酸是其中一种微生物胞外多糖，固体是白色纤维状的无定型结构杂多糖，主要由D
‑
葡萄糖醛酸、D
‑
葡萄糖、D
‑
半乳糖和L
‑
岩藻糖组成，组成比例为 1:2:2:1，还包含O
‑
乙酰和丙酮酸等多种侧链上的化学修饰结构。分子量最大可达1000万道尔顿以上的高分子量聚合杂多糖。
[0003]微生物胞外多糖具有独特的物理和流变特性，在食品工业中被广泛用作稳定剂、增稠剂、凝胶剂和乳化剂。近年来研究发现细菌多糖在抗肿瘤、抗病毒、免疫刺激、抗炎症活性和抗氧化作用、抗微生物作用等方面表现出了显著的生物活性，因此引起了人们的更多关注。2017年在杂志cell上首次报道了可拉酸使得线粒体片段化且具有延长秀丽隐杆线虫寿命的作用。可拉酸由于其多孔的纤维素结构和位于胶体表面的大量亲水基团，是一种天然的水凝胶，具有优异的补水能力和柔软的质地，是未来化妆品和医疗保健市场的良好候选产品。此外，可拉酸作为一种独特的活性生物聚合物，具有特殊的生物学特性和生理参数，对延长寿命及抗衰老方面具有广泛的研究与应用前景。
[0004]大肠杆菌在表达可拉酸的同时，相应的会产生与目标物相似的杂质如单糖、蛋白、核酸、细胞碎片、糖蛋白等，这些杂质影响可拉酸最终的含量与纯度，对产品质量的好坏有重要影响。文献中报道多采用离心去除菌体乙醇沉淀的方式来分离纯化可拉酸，再用sevag法去除核酸和蛋白杂质。如何高效的将蛋白和核酸等杂质的残留量降到极低的水平，是产品大规模生产和医药和医美应用的关键。但是，目前仍然没有商品化的可拉酸产品，也缺少完善的可拉酸生产与纯化方法，这严重限制了可拉酸的商业化应用。
[0005]多糖领域通常采用乙醇沉淀来粗纯、盐析或sevag法除蛋白、最后采用阴离子层析的方法来精纯化多糖。Sevag法是经典的除蛋白质方法，但损失大、溶剂不友好、难以放大且不能完全去除蛋白杂质。DEAE阴离子层析脱色、除杂适合分子量小于2000KDa的多糖纯化，因为填料孔径的原因对于超高分子量的可拉酸并不适用。
[0006]专利CN113637620A采用煮沸后离心去除菌体，接着冰醋酸沉淀去除脂多糖，采用氯仿和甲醇去除杂质蛋白，冷冻干燥得到固体。报道的方法中使用了有毒害的有机溶剂，且核酸和蛋白杂质去除不彻底，同时也不适合放大生产。
[0007]专利CN111893150A公布了采用煮沸后离心去除菌体，接着加入冰醋酸沉淀脂多糖，上清液旋转蒸发减少水分后冷冻干燥得粗品。粗品复融后，超滤除盐，接着冷冻干燥得产品可拉酸。报道的方法中需要煮沸和旋转蒸发手段导致效率低，放大实现难度大，同时对关键杂质蛋白和核酸的去除没有研究，方法不适合大规模生产高纯度的可拉酸产品。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种低成本、高纯度、可放大纯化制备1000万道尔顿分子量可拉酸的方法。
[0009]本专利技术根据上述技术背景的不足，提供了一种1000万道尔顿可拉酸的分离纯化工艺，该工艺方法简单、成本低廉、工艺环保，可以有效去除蛋白、核酸类杂质及一些相对小分子量的杂质。
[0010]本专利技术的纯化方法以可拉酸发酵液为原料，包含以下步骤：1、发酵液中加入CaCl2进行固液分离预处理；2、滤液进行聚合物反相层析；3、流穿液进行复合填料串联层析；4、流穿液进行超滤浓缩换液；5、乙醇沉淀、脱水、真空干燥。
[0011]根据上述提供的方法，步骤1向发酵液中加入0.1～2.0wt%的CaCl2溶液，调节pH8.0～10.0进行絮凝预处理；离心或板框压滤去除菌体等沉淀物，得到澄清液。
[0012]将步骤1中的澄清液进行流穿模式反相层析纯化，调节样品pH6.0～9.0，上样载量100～300mg/mL,保留时间2～6分钟，收集流穿液A。聚合物反相填料基质可以是聚甲基丙烯酸酯类或聚苯乙烯类，所用的填料孔径大小为500～2000A，填料粒径大小为50～150μm。
[0013]将步骤2中的流穿液A进行串联羟基磷灰石和离子复合填料层析纯化，上样载量200～400mg/mL,保留时间2~6分钟，收集流穿液B。羟基磷灰石为CHT II型，离子复合填料为阴离子与疏水复合填料，粒径为30～150μm。
[0014]将步骤3中的流穿液B进行中空纤维膜超滤浓缩和换液，流穿液B中加EDTA固体，控制跨膜压力＜1Bar，样品先进行浓缩3~5倍，接着用超纯水洗滤3～7倍，超滤结束后排空收集截留液，1～3倍死体积的超纯水循环洗膜5~20min后排空收集。合并截留液与洗膜液得到溶液C。超滤膜孔径为50～300KD。
[0015]向步骤4中的溶液C中加入1.5～4倍体积的95%(V/V，下同)乙醇，接着缓慢滴加饱和氯化钠溶液至其终浓度为1～3wt%，静置收集沉淀。向沉淀中加入95%乙醇进行脱水，脱水两次，每次脱水1～3h。脱水后，滤掉乙醇进行真空干燥，干燥温度为30～50℃，干燥时间3~6h，将固体研磨过200目筛。接着继续干燥8～15h，收集得最终产品。
[0016]本专利技术的效果与现有技术相比，本专利技术采用了聚合物反相填料、羟基磷灰石串联离子复合填料等连续纯化手段，可以制备得到1000万道尔顿高分子量可拉酸，并且在超滤换液时可以加入螯合剂以去除重金属离子杂质，使用乙醇沉淀时采用先加乙醇，再滴加氯化钠的方式可以制备得到细微颗粒状的可拉酸，便于后续取用。
[0017]本专利技术提供的透明质酸发酵液分离纯化方法为清洁生产工艺，不使用活性炭，无添加任何毒害物质，超滤浓缩后最小量的乙醇加入，生产的成品因此更加安全、环保。本专利技术提供的对可拉酸发酵液分离纯化方法，采用流穿的层析模式能够大规模、高效率的制备1000万道尔顿以上的可拉酸。本专利技术提供的对可拉酸发酵液分离纯化方法，制备所得的产品蛋白残留＜0.1%、核酸残留A260＜0.1（2g/L）、重金属残留＜10ppm及内毒素符合药用级要求。
附图说明
[0018]图1为实施例1的GPC色谱图；图2为可拉酸纯化工艺流程图。
具体实施方式
[0019]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术，对于本领域的技术人员来说在此专利技术创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本专利技术的保护范围。实施例中所用的原料均可以通过商业途径获得。
[0020]以下结合具体实施例对本专利技术的具体实现进行详细描述。
[0021]本专利技术中使用的可拉酸发酵液由深圳柏垠生物有限本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可放大的可拉酸纯化方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1：向可拉酸发酵液中加入CaCl2，调节pH值，进行絮凝预处理，然后进行固液分离，得到澄清液；步骤2：将上述澄清液进行流穿模式反相层析纯化，收集流穿液A；步骤3：将上述流穿液A进行复合填料串联层析纯化，得到流穿液B；步骤4：将上述流穿液B进行超滤，超滤结束后收集截留液，纯水洗膜后，收集洗膜液，合并截留液与洗膜液得到溶液C；步骤5：向溶液C中先加入乙醇，接着滴加氯化钠溶液，然后静置沉淀，即得纯化后的可拉酸。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1中：所述的CaCl2以水溶液的形式加入，且其浓度为0.1~2.0wt%，所述pH值的范围为8.0~10.0，所述固液分离的方法为离心或板框压滤。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤2中：所述的反相层析中层析柱的填料为聚合物反相填料基质，且上样前还需将步骤1中所述的澄清液的pH值调整为6.0~9.0。4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，步骤2中：所述的聚合物反相填料基质为聚甲基丙烯...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗明明，张柳静，周淑清，崔俊锋，钟超，金学荣，赵裕栋，
申请(专利权)人：深圳柏垠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：