一种三重PCR检测引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种三重PCR检测引物组及试剂盒。属于生物技术领域。包括：pld

【技术实现步骤摘要】
一种三重PCR检测引物组及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种三重PCR检测引物组及试剂盒。

技术介绍

[0002]在针对羊干酪性淋巴结炎的现有PCR检测方法中，从病原菌角度，大多围绕伪结核棒状杆菌一种细菌建立检测方法，但国内外诸多学者及本单位研究结果表明，羊干酪性淋巴结炎脓肿组织中分离的细菌最多的为金黄色葡萄球菌，其次为伪结核棒状杆菌和化脓隐秘杆菌，且经动物回归试验表明，3种细菌均能引起实验羊相似的特征性临床症状和病理变化，只是感染严重程度不同，因此，针对其中1种细菌建立检测方法不够全面。
[0003]也有关于3种细菌的三重PCR检测方法的建立，但与本专利技术中应用的目的基因不一致，存在特异性不足等问题。
[0004]因此，如何提供一种效果更优的三重PCR引物组及检测试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种三重PCR检测引物组及试剂盒。本专利技术选用的均为3种细菌的特异性毒力基因，能够进一步提高检测方法的特异性，减少或消除后期测序步骤，节省检测周期和成本；且本专利技术中建立的检测方法，已成功制备可供直接应用的试剂盒，具备便捷应用能力。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种三重PCR检测引物组，包括：pld
‑
F/R、plo
‑
F/R和nuc
‑
F/R，其中，pld
‑
F核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，pld
‑
R核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；plo
‑
F核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，plo
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R核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；nuc
‑
F核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，nuc
‑
R核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0008]本专利技术还提供了含有上述引物组的试剂或试剂盒。
[0009]本专利技术还提供了一种非诊断治疗目的检测伪结核棒状杆菌ATCC19410的pld基因、化脓隐秘杆菌ATCC19411的plo基因、金黄色葡萄球菌ATCC25923的nuc基因的方法，使用上述的引物。
[0010]有益效果：本专利技术确定伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌和金黄色葡萄球菌是当前我国羊干酪性淋巴结炎性脓肿组织中分离率最高的3种细菌，并均能引起羊干酪性了淋巴结炎样病变。
[0011]针对3种细菌选定的pld、plo、nuc基因分别在伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌和金黄色葡萄球菌中携带率为100％。
[0012]优选的：包括扩增体系：2
×
Taq PCR MasterMix15μL，0.4μmol/L上、下游引物各0.6μL，模板3μL，剩余由无菌DEPC水补齐至30μL。
[0013]优选的，包括扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸
40s，共35个循环；72℃终延伸10min。
[0014]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种三重PCR检测引物组及试剂盒，取得的技术效果为提供一种羊干酪性淋巴结炎(伪结核)中3种常见病原菌的三重PCR检测引物组和检测试剂盒。本专利技术分别以伪结核棒状杆菌磷脂酶D(pld)基因、化脓隐秘杆菌溶血素(plo)基因和金黄色葡萄球菌耐热核酸酶(nuc)基因为目的基因设计3对引物，建立特异性强、灵敏度高、快速准确的三重PCR检测方法和试剂盒。用于羊干酪性淋巴结炎中伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌和金黄色葡萄球菌的临床和实验室PCR检测，在羊干酪性淋巴结炎的病原快速检测、流行病学调查等方面具有广泛应用潜力。此外，还可用于羊干酪性淋巴结炎之外的伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌和金黄色葡萄球菌的单一和联合检测。
[0015]试剂盒中提供阳性对照菌株DNA和PCR反应各种所需试剂。本专利技术提供的检测方法和检测试剂盒，能够对羊干酪性淋巴结炎的动态监测、流行病学调查、临床和实验室检测、综合防治和净化等方面提供可靠方法。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0017]图1附图为本专利技术提供的引物特异性评价图，其中，M：DL2000 DNA Marker；1：伪结核棒状杆菌；2：化脓隐秘杆菌；3：金黄色葡萄球菌；4：肺炎克雷伯菌；5：大肠杆菌；6：铜绿假单胞菌；7：产气荚膜梭菌；8：链球菌；9：阴性对照。
[0018]图2附图为本专利技术提供的不同退火温度反应结果图，其中，M：DL2000DNA Marker；1：54℃；2：53℃；3：55℃；4：56℃；5：57℃。
[0019]图3附图为本专利技术提供的不同引物浓度反应结果图，其中，M：DL2000DNA Marker；1：0.2μmol/L；2：0.4μmol/L；3：0.6μmol/L；4：0.8μmol/L；5：1.0μmol/L。
[0020]图4附图为本专利技术提供的三重PCR不同菌体数量检测敏感性检测图。
[0021]图5附图为本专利技术提供的三重PCR对不同细菌DNA浓度敏感性检测图。
具体实施方式
[0022]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]本专利技术实施例公开了一种三重PCR检测引物组及试剂盒。
[0024]实施例1
[0025]引物设计
[0026]分别以伪结核棒状杆菌ATCC19410的pld基因、化脓隐秘杆菌ATCC19411的plo基因、金黄色葡萄球菌ATCC25923的nuc基因为目的基因，分别合成扩增对应基因的PCR引物
(表1)：
[0027]表1合成引物信息
[0028][0029]实施例2
[0030]引物特异性评价
[0031]分别对实验室分离保存的伪结核棒状杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌和链球菌分离株提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR，检验所设计的引物是否能特异性扩增出目标菌的目的基因。
[0032]反应体系为30μL，其中2
×
Taq PCR MasterMix添加15μL，每一引物各0.6μL(10μmol/L)，模板含量3μL，剩余由无菌DEPC水补齐至30μL。反应程序为94℃预变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三重PCR检测引物组，其特征在于，包括：pld
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F/R、plo
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F/R和nuc
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F/R，其中，pld
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F核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，pld
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R核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；plo
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F核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，plo
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R核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；nuc
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F核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，nuc
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R核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨增岐，王斌，白新栋，王晨骁，魏宇辰，冯航，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：