治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶及其制备方法，具体包括以下步骤：一)脱细胞基质的制备：1)同种异体化细胞的提取：1A)基质细胞的提取(以肿瘤相关成纤维细胞为例)；1B)免疫细胞的提取(以巨噬细胞为例)；2)脱细胞基质的提取；二)脱细胞基质复合水凝胶的制备。本发明专利技术优点在于：制作方法简单，天然无毒，使用简便，安全有效，有效缓解瘤内免疫抑制水平，防止肿瘤复发及转移，具有很好的推广前景。推广前景。推广前景。

【技术实现步骤摘要】
治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶及其制备方法


[0001]本专利技术涉及医疗卫生
，具体是指一种治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶及其制备方法。

技术介绍

[0002]乳腺癌(Breast Cancer，BC)是女性中常见癌症，三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer，TNBC) 是最具侵袭性和异质性的BC亚型。临床上通过手术清除乳腺肿瘤后，仍存在较高的复发或转移风险，其重要原因是手术无法将原位残留的肿瘤细胞彻底清除。TNBC独特的细胞表型、侵袭性、转移潜能以及受体、靶点的缺乏，使得化疗成为其首选治疗方案，然而与其它BC亚型相比，TNBC的预后效果最差，其治疗干预需求仍未得到满足。因此急需开发出一种新型、安全和高效的免疫治疗方式，以完善TNBC预后治疗的研究工作。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶及其制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：
[0005]一)脱细胞基质的制备：
[0006]1)同种异体化细胞的提取：
[0007]1A)基质细胞的提取(以肿瘤相关成纤维细胞为例)：将Balb/c小鼠肿瘤组织及癌旁组织放入培养皿，用含20％双抗(青霉素与链霉素)的PBS洗涤3次，用剪刀将组织破碎并置于50mL离心管中，用5
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10mL 胶原酶在37℃下孵育消化1h，经100μm孔径的滤网过滤，滤后的细胞悬液转入50mL离心管中，于200 g转速下离心3min，摒弃上清液后加入10mL PBS小心吹打细胞，继续离心3min，吸去上清液后用含10％ FBS的培养基吹散细胞并分装至培养皿中进行体外培养，细胞开始贴壁生长后，用PBS小心清洗培养皿，肿瘤相关成纤维细胞可贴壁生长，其它细胞随PBS滑落，获得贴壁的肿瘤相关成纤维细胞并体外培养扩增；
[0008]1B)免疫细胞的提取(以巨噬细胞为例)：取Balb/c小鼠的股骨与胫骨，去除皮肤与肌肉组织后，用含20％双抗的PBS洗涤3次，用剪刀去除关节头，用1mL注射器吸取培养基后冲洗骨髓腔，获得细胞悬液后在400g转速下离心5min，用红细胞裂解液去除红细胞，将获得的骨髓细胞转入100mm培养皿中进行体外培养，培养基为含20％FBS、1％双抗、20ng/mL GM
‑
CSF和20ng/mL LPS的DMEM条件培养基，继续培养1周后获得M1极性表型的骨髓来源巨噬细胞；
[0009]2)脱细胞基质的提取：配制10mg/mL的海藻酸钠溶液，收集基质细胞与免疫细胞后按细胞数1:1的比例与海藻酸钠溶液混匀，总细胞密度为5
×
106个/mL,将含有免疫细胞的海藻酸钠溶液用去除针头的1 mL注射器吸取，小心滴入20mM的CaCl2溶液中，形成水凝胶微球，待微球稳定后转入培养基中体外培养1周；用液氮冷却水凝胶微球并迅速用研钵破碎，
加入海藻酸降解酶使微球降解完全，用去DNA酶与去RNA酶降解微球内的核酸，于5000g转速下用PBS反复离心清洗3次，在
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50℃下冻干获取脱细胞基质；
[0010]二)脱细胞基质复合水凝胶的制备：配制10mg/mL的透明质酸钠与10mg/mL的海藻酸钠混合溶液，加入10mg/mL的脱细胞基质后充分搅拌混匀，将混合溶液用去除针头的1mL注射器吸取后，小心滴入 20mM的CaCl2溶液中，形成脱细胞基质复合水凝胶。
[0011]一种由上述步骤所制得的治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶。
[0012]本专利技术优点在于：纯天然、无化学药物，提取方法简便、易操作，免疫治疗效果良好、对健康组织无毒副作用，天然无毒，使用简便，安全有效，有效缓解瘤内免疫抑制水平，防止肿瘤复发及转移，具有很好的推广前景。
[0013]本专利技术治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶的使用方法：本专利技术所制脱细胞基质复合水凝胶，使用时将水凝胶微球填塞至三阴性乳腺癌术后创口内，缝合创口即可，1周内水凝胶降解，有效缓解瘤内免疫抑制水平，防止肿瘤复发及转移。
附图说明
[0014]图1是水凝胶维持M1型巨噬细胞抗肿瘤功能活化图。
[0015]图2是脱细胞基质选择性杀灭肿瘤细胞，促巨噬细胞抗肿瘤功能活化图。
[0016]图3是脱细胞基质可在免疫抑制环境中调控巨噬细胞极性图。
[0017]图4是基质复合水凝胶可植入肿瘤术后动物模型图。
[0018]图5是脱细胞基质复合水凝胶可有效防止肿瘤复发图。
[0019]图6是瘤内巨噬细胞数量变化情况图。
具体实施方式
[0020]下面用具体实施例说明本专利技术，并不是对本专利技术的限制。
[0021]实施例
[0022]治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：
[0023]一)脱细胞基质的制备：
[0024]1)同种异体化细胞的提取：
[0025]1A)基质细胞的提取(以肿瘤相关成纤维细胞为例)：将Balb/c小鼠肿瘤组织及癌旁组织放入培养皿，用含20％双抗(青霉素与链霉素)的PBS洗涤3次，用剪刀将组织破碎并置于50mL离心管中，用5
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10mL 胶原酶在37℃下孵育消化1h，经100μm孔径的滤网过滤，滤后的细胞悬液转入50mL离心管中，于200 g转速下离心3min，摒弃上清液后加入10mL PBS小心吹打细胞，继续离心3min，吸去上清液后用含10％FBS的培养基吹散细胞并分装至培养皿中进行体外培养，细胞开始贴壁生长后，用PBS小心清洗培养皿，肿瘤相关成纤维细胞可贴壁生长，其它细胞随PBS滑落，获得贴壁的肿瘤相关成纤维细胞并体外培养扩增；
[0026]1B)免疫细胞的提取(以巨噬细胞为例)：取Balb/c小鼠的股骨与胫骨，去除皮肤与肌肉组织后，用含20％双抗的PBS洗涤3次，用剪刀去除关节头，用1mL注射器吸取培养基后冲洗骨髓腔，获得细胞悬液后在400g转速下离心5min，用红细胞裂解液去除红细胞，将获得的骨髓细胞转入100mm培养皿中进行体外培养，培养基为含20％FBS、1％双抗、20ng/mL GM
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CSF和20ng/mL LPS的DMEM条件培养基，继续培养1周后获得M1极性表型的骨髓来源巨噬细
胞；
[0027]2)脱细胞基质的提取：配制10mg/mL的海藻酸钠溶液，收集免疫细胞后与海藻酸钠溶液混匀，细胞密度为5
×
106个/mL，将含有免疫细胞的海藻酸钠溶液用去除针头的1mL注射器吸取，小心滴入20mM 的CaCl2溶液中，形成水凝胶微球，待微球稳定后转入培养基中体外培养1周；用液氮冷却水凝胶微球并迅速用研钵破碎，加入海藻酸降解酶使微球降解完全，用去DNA酶与去RNA酶降解微球内的核酸，于 50本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.治疗三阴性乳腺癌的脱细胞基质复合水凝胶的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：一)脱细胞基质的制备：1)同种异体化细胞的提取：1A)基质细胞的提取(以肿瘤相关成纤维细胞为例)：将Balb/c小鼠肿瘤组织及癌旁组织放入培养皿，用含20％双抗(青霉素与链霉素)的PBS洗涤3次，用剪刀将组织破碎并置于50mL离心管中，用5
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10mL胶原酶在37℃下孵育消化1h，经100μm孔径的滤网过滤，滤后的细胞悬液转入50mL离心管中，于200g转速下离心3min，摒弃上清液后加入10mL PBS小心吹打细胞，继续离心3min，吸去上清液后用含10％FBS的培养基吹散细胞并分装至培养皿中进行体外培养，细胞开始贴壁生长后，用PBS小心清洗培养皿，肿瘤相关成纤维细胞可贴壁生长，其它细胞随PBS滑落，获得贴壁的肿瘤相关成纤维细胞并体外培养扩增；1B)免疫细胞的提取(以巨噬细胞为例)：取Balb/c小鼠的股骨与胫骨，去除皮肤与肌肉组织后，用含20％双抗的PBS洗涤3次，用剪刀去除关节头，用1mL注射器吸取培养基后冲洗骨髓腔，获得细胞悬液后在400g转速下离心5min，用红细胞裂解液去除红细胞，将获得的骨髓细胞转入100mm培养皿中进行体外培...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪忆庐，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：