一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关与应用技术方案

本发明专利技术具体公开一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关，以及在V.vulnificus检测中的应用，实现了无需昂贵仪器设备的V.vulnificus现场检测，且检测结果肉眼可见；本发明专利技术中将等温扩增技术RPA与核糖开关相耦合，检测V.vulnificus保守序列的灵敏度为4.30

【技术实现步骤摘要】
一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关与应用


[0001]本专利技术属于病原微生物检测及分子诊断的
，具体涉及一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关与应用。

技术介绍

[0002]V.vulnificus是海洋中最常见的弧菌科细菌之一，广泛分布在近岸海域的海水、海洋生物的体表和肠道中，人类感染这种细菌一般有两种途径：使用海鲜与接触海水或海产品。V.vulnificus是一种危险的人类病原体，是所有食源性病原体中病死率最高的。V.vulnificus感染的特点是潜伏期短，通常在感染的24h内就会出现症状，在48h内出现感染性休克、皮肤肌肉坏死、脓毒血症，进而引起多脏器功能衰竭，伤口感染的总死亡率约为25％，但在患有潜在肝病的患者中上升至54％。由于这种细菌可引起严重感染，及时进行抗菌治疗是必不可少的。因此，在临床环境中准确快速地识别这种细菌是至关重要的。
[0003]大多数临床微生物学实验室仍然依靠培养来检测临床样本中的V.vulnificus。例如，使用选择培养基分离特定目标病原体，分离出细菌后，利用MALDI
‑
TOF MS鉴定V.vulnificus，其检测具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点。但是依靠培养来检测临床样本中的V.vulnificus的方法仍存在一些局限性，检测时间通常需要16～48h，且无法检测一些难以进行分离培养的病原微生物，因此，目前主要用于培养基础上的鉴定。近年来，使用PCR检测手段得到快速发展，可进行种属水平的鉴定，各种以PCR为基础的DNA扩增技术如荧光定量RCR、逆转录PCR、数字PCR等技术，已成为医学临床和检验部门强有力的分析工具，
[0004]在实际应用场景下，待检测样本中病原微生物含量低，需经过核酸扩增获取大量目标基因片段，因此，PCR检测手段进行V.vulnificus的快速识别成为一种具有较大发展潜力的方法。但是，现有的各种PCR技术需要热循环过程，无法摆脱对仪器设备的依赖，从而限制了其在临床现场检测V.vulnificus中的应用。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关及其制备方法，并将制得的基于无细胞转录翻译系统的核糖开关用于现场即时检测V.vulnificus。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术目的之一在于提供一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关，所述核糖开关是根据细菌保守序列RNA设计的具有立足结构的RNA序列，可与V.vulnificus保守序列RNA发生碱基互补配对，激活报告蛋白的表达；所述核糖开关是由两条RNA链组成，分别为Sensor RNA和Trigger RNA，Sensor RNA为核糖开关，Trigger RNA用于激活核糖开关；Sensor RNA序列由Sensor DNA序列体外转录而来，Trigger RNA序列由Trigger DNA序列体外转录而来。
[0008]进一步的，所述Trigger DNA序列是由带有pT7启动子的上游引物和下游引物从V.vulnificus中等温扩增而来，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，Trigger DNA序列如SEQ ID NO:3所示。
[0009]进一步的，所述Sensor DNA序列是可编程的，根据所选择的V.vulnificus保守序列Trigger DNA设计而来，Sensor DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
[0010]本专利技术的目的之二在于提供如上所述的基于无细胞转录翻译系统的核糖开关在临床检测V.vulnificus中的应用。
[0011]进一步的，将基于无细胞转录翻译系统的核糖开关在临床检测V.vulnificus中的应用，包括以下步骤：
[0012]利用RPA等温扩增方法对V.vulnificus保守序列进行扩增，在无细胞转录翻译系统中，扩增产物在T7 RNA聚合酶的作用下，T7启动子启动转录过程，以得到大量Trigger RNA；
[0013]无细胞转录翻译系统中，Sensor DNA转录出核糖开关SensorRNA，以识别Trigger RNA，激活报告蛋白的表达；
[0014]根据表达的报告蛋白与底物的显色反应，从而确定目标菌为所检测V.vulnificus。
[0015]相较于现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0016]1、本专利技术提供的核糖开关中Sensor RNA与V.vulnificus保守序列RNA的识别是依赖于RNA
‑
RNA的链置换相互作用，通过碱基互补配对的原则，解除RNA适体立足结构对翻译过程的阻遏作用，从而促进报告蛋白的表达；根据实验数据表明，本专利技术所设计的核糖开关具有高动态范围、高特异性等特点，同时核糖开关通过可编程的设计，具有高通用性以响应任意RNA序列。
[0017]2、本专利技术中无细胞转录翻译系统(TX
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TL)是V.vulnificus利用细胞粗提物以代替完整细胞来启动转录翻译过程，它可以绕过分子跨细胞壁运输的限制，通过向提取液中加入遗传物质和外源能量，在短时间内体外启动mRNA和蛋白质的合成，将TX
‑
TL系统与本专利技术设计的核糖开关相结合，应用于病原微生物的检测，可提高检测的便捷性和及时性。实验数据表明，在不依赖于设备仪器的情况下，可在3h内实现V.vulnificus保守序列的检测。
[0018]3、在实际应用场景下，待检测样本中病原微生物含量低，需经过核酸扩增获取大量目标基因片段，本专利技术在实际应用中利用RPA等温扩增技术进行扩增，缩短扩增时间、且稳定性强，可实现在常温下目标基因片段的指数级扩增；本专利技术将RPA等温扩增技术与核糖开关相耦合，结合TX
‑
TL系统，检测V.vulnificus的保守序列，实现检测的灵敏度为4.30
×
103copies/μL。
附图说明
[0019]图1为本专利技术核糖开关报告子为degfp基因时，V.vulnificus的Sensor质粒与Trigger质粒在TX
‑
TL体系中不同浓度下的反应结果示意图；
[0020]其中，图(A)、(B)为Sensor
‑
V1质粒；图(C)、(D)为Sensor
‑
V2质粒；图(E)、(F)为Sensor
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V3质粒；
[0021]图2为本专利技术核糖开关报告子为lacZ基因时，Sensor
‑
V2质粒在不同浓度下的反应
结果示意图；
[0022]其中，图(A)、(B)、(C)、(D)、(E)分别为Sensor
‑
V2质粒浓度为0、5、10、20、30nM时的实时反应结果图；图(F)为反应时间为3h时，Sensor
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V2质粒各浓度下的反应终点值；
[0023]图3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关，其特征在于：所述核糖开关是根据细菌保守序列RNA设计的具有立足结构的RNA序列，可与V.vulnificus保守序列RNA发生碱基互补配对，激活报告蛋白的表达；所述核糖开关是由两条RNA链组成，分别为Sensor RNA和Trigger RNA，Sensor RNA为核糖开关，Trigger RNA用于激活核糖开关；所述Sensor RNA、Trigger RNA分别由Sensor DNA、Trigger DNA体外表达系统转录而来。2.如权利要求1所述的一种基于无细胞转录翻译系统的核糖开关，其特征在于：所述Trigger DNA序列是由带有pT7启动子的上游引物和下游引物从V.vulnificus中等温扩增而来，上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，上游引物的序列如SEQ ID NO:2所示，Trigger DNA序列如SEQ ID NO:3所示，该序列在体外表达系统中转录得到Trigger RNA序列。3.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭绍彬，金天宇，石贤爱，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：