一种应用于细胞内两种蛋白相互作用的可视化验证方法技术

本发明专利技术公开了一种应用于细胞内两种蛋白相互作用的可视化验证方法，将荧光蛋白TagBFP2分为两个荧光蛋白截断体，并将两个荧光蛋白截断体的DNA序列分别构建至两个质粒载体中，随后将研究相互作用的两个蛋白质序列分别插入前述含有荧光蛋白截断体序列的质粒载体中，使待研究的两个目的蛋白分别与两个荧光蛋白截断体的头尾连接形成融合蛋白，荧光蛋白截断体与目的蛋白之间均以10个氨基酸的寡肽连接，在细胞中共表达这两种融合蛋白，通过荧光显微镜观察在合适的激发光下是否存在荧光，以此判断两目的蛋白是否能发生相互作用。以此判断两目的蛋白是否能发生相互作用。以此判断两目的蛋白是否能发生相互作用。

【技术实现步骤摘要】
一种应用于细胞内两种蛋白相互作用的可视化验证方法


[0001]本专利技术属于生物科学领域，涉及一种应用于细胞内两种蛋白相互作用的可视化验证方法。

技术介绍

[0002]蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的重要组成部分，蛋白
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蛋白互作网络与调控网络对细胞正常生理功能或病理机制的调控具有重要意义。目前验证两蛋白分子相互作用经典方法为免疫共沉淀(CoIP)，但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须经过高通量，生信预测等方法预筛出可能相互的蛋白，然后购买相应的抗体，作为一种验证实验，CoIP需要购买昂贵的专用抗体，作为课题/项目初期的验证实验成本较高。
[0003]除了免疫共沉淀，酵母双杂交技术同样在蛋白互作验证中广泛应用。但由于酵母双杂的原理限制，两相互作用的分子必须表达在核内或在核内有分布，才能保证酵母双杂实验顺利实施。这限制了酵母双杂交技术在实际中的应用。
[0004]荧光能量转移技术(FRET)作为新发现的蛋白互作验证技术，因其可视化的优点受到众多学者的青睐。但价格不菲的精尖设备以及复杂的实验设计也将众多实验室/研究平台拒之门外。
[0005]相较于前述的几种蛋白互作验证方法，双分子荧光互补技术(BiFC)只需要构建几个质粒便可实现蛋白互作的可视化监测。在实验初期的验证，得益于其较低的投入以及简单易行的操作过程能够帮助课题组或缺乏高端仪器设备的实验室/研究平台完成互作蛋白的初步验证。
专利技术内容
[0006]针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种应用于细胞内两种蛋白相互作用的可视化验证方法，所述的这种应用于细胞内两种蛋白相互作用的可视化验证方法要解决现有技术中验证两蛋白分子相互作用的方法复杂、成本高的技术问题。
[0007]一种应用于细胞内两种蛋白相互作用的可视化验证方法，将荧光蛋白TagBFP2的DNA序列截断形成两个荧光蛋白截断体，所述的荧光蛋白TagBFP2的三个氨基酸残基截断位点为151D/152G，166G/167G，191G/192V，从任一位点截断均可产生N/C端两个荧光蛋白截断体，将两段荧光蛋白截断体DNA序列分别构建至两个质粒载体中，随后将待研究相互作用的两个蛋白质DNA序列分别插入前述含有荧光蛋白截断体的质粒载体中，使其表达目的蛋白与荧光蛋白截断体的头尾连接形成的融合蛋白，任意一个荧光蛋白截断体与目的蛋白之间以10个氨基酸的寡肽连接，在细胞中共表达这两种融合蛋白，如果前述的待研究相互作用的两种蛋白能够发生相互作用，则两个荧光蛋白截断体相互靠近，通过自我催化形成具有活性的完整荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发下，通过荧光显微镜观察可以看到荧光；反之，如果前述的待研究相互作用的两种蛋白不能够发生相互作用，则两个不发光肽段不
相互靠近，不能通过自我催化形成具有活性的完整荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发，荧光显微镜观察看不到明显荧光，以此判断两目的蛋白是否能发生相互作用。
[0008]进一步的，在细胞内共表达上述两个仅含荧光蛋白截断体的质粒时，其表达的两个荧光蛋白截断体不能自发融合形成完整荧光蛋白。
[0009]进一步的，利用特异性中间引物和聚合酶链式反应，将荧光蛋白的DNA序列分为两段，而后将两段截断体序列构建至质粒载体中，此质粒表达的荧光蛋白截断体均不能独自发出荧光。
[0010]进一步的，所述的荧光蛋白为TagBFP2，其最大激发波长为399nm，最大发射波长为454nm。
[0011]进一步的，在所述的荧光蛋白TagBFP2的任意一个氨基酸残基截断位点截断后分别产生N/C端两个截断体，分别命名为BN151/BC152、BN166/BC167、BN191/BC192，而后将任一截断体对分别连接至目的互作蛋白头尾，用于双分子荧光互补实验。
[0012]进一步的，3对含编码上述的荧光蛋白截断体质粒，在N端片段头端和C端片段尾端可分别插入目的蛋白序列，两荧光蛋白截断体与目的蛋白之间均插入了一段10个氨基酸的连接寡肽GGGGSGGGGS以保证融合蛋白的两组分充分的活动性，不会影响彼此的正常生理结构和功能；以及限制性内切酶XhoI酶切位点CTCGAG或EcoRI酶切位点GAATTC，以便于后续目的蛋白DNA序列的插入。
[0013]进一步的，包含荧光蛋白片段载体质粒分别被命名为pHY009
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BN151/pHY009
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BC152，pHY009
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BN166/pHY009
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BC167，pHY009
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BN191/pHY009
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BC192。
[0014]进一步的，所述的目的蛋白的前端蛋白序列删除终止密码子以保证融合蛋白的正确表达。
[0015]本专利技术首次将TagBFP2应用于双分子荧光互补技术，并确认了TagBFP2肽链上三个截断位点，在此位点截断并将N/C段连接至不同的蛋白头/尾端以实现两种蛋白互相作用的可视化。
[0016]本专利技术确认了TagBFP2三个氨基酸残基位点151D/152G，166G/167G，191G/192V，可将TagBFP2从此三个位点任一位点截断，而后N/C两段可被连接至不同蛋白末端，当两互作蛋白在细胞内互相靠近发生相互作用，N/C端截断体也相互靠近并自我催化形成完整荧光蛋白TagBFP2，进而在合适的激发光的激发下产生荧光。
[0017]本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术操作简便，成本低廉，仅需将所研究的蛋白插入含有非荧光片段的载体质粒中，而后将质粒对共转染入细胞，适当培养和亚低温孵育后即可观察结果。本专利技术结果呈现生动直观，通过与假阳性对照对比荧光结果即可初步判断目的蛋白之间是否具有相互作用，而后再选择诸如CoIP等其它实验方法二次验证。此外根据实验室/科研平台的能力，可以构建多组质粒同时验证，大大提高验证实验效率。
附图说明：
[0018]图1为TagBFP2的立体模式图以及切割位点展示。
[0019]图2为本专利技术所使用的质粒图谱。
[0020]图3所示蓝色荧光为TagBFP2，左侧三组为实验组，pHY009
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Jun
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BN/pHY009
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BC
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Fos
共转染至Hela，箭头指向为TagBFP2的蓝色荧光；右侧三组为对照组，pHY009
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Jun
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BN/pHY
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BC
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FosΔbZIP共转染至Hela，未能观察到蓝色荧光。
[0021]图4为本专利技术所用到的质粒，专利技术原理及实验流程示意图，图A为两截断体与目的蛋白连接融合的序列示意图；图B为本专利技术的原理示意图；图C为本专利技术质粒转染及最终效果示意图。
具体实施方式
[0022]实施例1
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用于细胞内两种蛋白相互作用的可视化验证方法，其特征在于：将荧光蛋白TagBFP2截断形成两个荧光蛋白截断体，所述的荧光蛋白TagBFP2的三个氨基酸残基截断位点为151D/152G，166G/167G，191G/192V，从任一位点截断均可产生N/C端两个荧光蛋白截断体，将两个荧光蛋白截断体DNA序列分别构建至两个质粒载体中，随后将待研究相互作用的两个蛋白质DNA序列分别插入前述含有荧光蛋白截断体的质粒载体中，使其表达目的蛋白与荧光蛋白截断体的头尾连接形成的融合蛋白，任意一个荧光蛋白截断体与目的蛋白之间以10个氨基酸的寡肽连接，在细胞中共表达这两种融合蛋白，如果前述的待研究相互作用的两种蛋白能够发生相互作用，则两个荧光蛋白截断体相互靠近，通过自我催化形成具有活性的完整荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发下，通过荧光显微镜观察可以看到荧光；反之，如果前述的待研究相互作用的两种蛋白不能够发生相互作用，则两个不发光肽段不相互靠近，不能通过自我催化形成具有活性的完整荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发，荧光显微镜观察看不到明显荧光，以此判断两目的蛋白是否能发生相互作用。2.根据权利要求1所述的一种应用于细胞内两种蛋白相互作用的可视化验证方法，其特征在于：利用特异性中间引物和聚合酶链式反应，将荧光蛋白的DNA序列分为不发荧光的两段，而后将其构建至质粒载体中。3.根据权利要求1所述的一种应用于细胞内两种蛋白相互作用的可视化验证方法，其特征在于：所述的荧光蛋白为TagBFP2，其最大激发波长为399 nm，...

【专利技术属性】
技术研发人员：林盈盈，师忠港，高星，陈炳宏，王梦莹，张文蕊，廖克曼，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：