用于在单一凝血反应中确定狼疮抗凝物的方法技术

本发明专利技术涉及用于在单一凝血反应中确定狼疮抗凝物的方法。具体地，本发明专利技术涉及凝血诊断领域，并且公开了用于在患者的血浆样品中检测狼疮抗凝物的方法和自动分析仪。狼疮抗凝物的方法和自动分析仪。狼疮抗凝物的方法和自动分析仪。

【技术实现步骤摘要】
用于在单一凝血反应中确定狼疮抗凝物的方法


[0001]本专利技术属于凝血诊断领域，并且涉及用于检测狼疮抗凝物(lupus anticoagulant)的方法。

技术介绍

[0002]狼疮抗凝物(LA)是免疫球蛋白并且属于获得性自身抗体的类型。它们引起抗磷脂综合征(APS)，这是最常见的自身免疫性疾病之一，并且引起血栓形成、复发性流产以及妊娠期并发症。狼疮抗凝物免疫球蛋白是所谓的抗磷脂抗体(APA)，其结合阴离子磷脂、蛋白质或蛋白质/磷脂复合物。与某些蛋白和磷脂形成复合物的抗磷脂抗体是自身抗体的非常多样化(异质，heterogeneous)的组，其可以针对多种抗原，诸如针对载脂蛋白β2
‑
糖蛋白I(β2GPI)、心磷脂、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、血栓调节蛋白、因子XII等，并且针对这些蛋白与磷脂的复合物。
[0003]所谓的狼疮抗凝物是抗磷脂抗体，根据定义，该抗体延长某些凝血测试(例如APTT)的凝血时间。矛盾的是，狼疮抗凝物在体外会引起凝血反应的抑制；而在体内，增加的凝血反应(高凝性)与抗磷脂综合征(APS)相关。
[0004]抗磷脂综合征(APS)的实验室诊断因抗磷脂抗体的多样性(异质性，heterogeneity)而复杂化。为了直接检测抗体，使用免疫学方法。然而，在此还检测到许多在体内不具有凝血作用的抗体。对于抗体的间接功能检测，使用凝血测试。在凝血测试中，患者的血浆样品通常与凝血激活剂、磷脂和钙离子混合，并且测量的是直至凝块形成的时间。基于确定DRVVT(稀释的Russell氏毒液时间)的特别测试显示与抗磷脂抗体的凝血功效相对良好的相关性。狼疮诊断是非常复杂的，因为每个患者样品必须经过多个分析步骤(关于综述，参见：Devreese,K.and Hoylaerts,M.F.,Challenges in the diagnosis of the antiphospholipid syndrome.Clin.Chem.2010,56(6):930
‑
940)。
[0005]通常，使用至少一种凝血测试的两种变体来分析患者样品，以诊断狼疮抗凝物。在对狼疮抗凝物敏感的第一变体中，在相对低浓度的磷脂的存在下进行测试(筛选测试)；在对狼疮抗凝物不敏感的第二变体中，在存在相对高浓度的磷脂的情况下进行相同的测试(确认测试)。以下两者的结合指示狼疮抗凝物的存在：在第一测试变体(筛选测试)中，与正常样品(不含狼疮抗凝物)相比，延长的凝血时间；在第二测试变体(确认测试)中，与正常样品相比，延长的凝血时间。
[0006]特别常用的测试是DRVVT测试，其中对狼疮抗凝物敏感的第一变体用含有Russell氏毒液和相对低浓度的磷脂的活化试剂(LA1筛选试剂)进行，对狼疮抗凝物不敏感的第二变体用含有Russell氏毒液和高浓度的磷脂的活化试剂(LA2确认试剂)进行。如果LA1测试是阴性的，即与比较标准相比没有测量到延长的凝血，则不再需要进行LA2测试。另一种常用的测试是APTT测试。
[0007]因此，不利的是，狼疮抗凝物的间接功能性检测总是要求进行至少两次凝血测试，这伴随着所要求的材料、时间和工作的增加。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种用于间接功能性检测体液样品中狼疮抗凝物的方法，该方法避免了上述缺点。
[0009]已经发现，可以通过确定用狼疮抗凝物敏感性APTT试剂进行的单一凝血反应的凝血时间和评估反应曲线的某些参数来检测狼疮抗凝物。
[0010]因此，本专利技术提供了用于检测患者血浆样品中的狼疮抗凝物的方法。该方法包括以下步骤：
[0011]通过向血浆样品中添加狼疮抗凝物敏感性APTT试剂提供反应混合物，并且开始凝血反应，
[0012]测量反应混合物随时间(t)的测量变量S，得到时间依赖性测量值的函数S(t)，以及
[0013]确定凝血时间。
[0014]根据本专利技术，在该方法中另外进行的是，
[0015]a)确定函数S(t)的最大反应速度v
max
和/或最大反应加速度a
max
，以及
[0016]b)确定测量开始时的第一测量值SB与测量结束时的第二测量值SE之间的差值的绝对值(|ΔS|)，并且然后
[0017]c)分别使用以下公式确定相对最大反应速度v
max rel
和/或相对最大反应加速度a
max rel
：
[0018]v
max rel
＝v
max
/|ΔS|，以及
[0019]a
max rel
＝a
max
/|ΔS|。
[0020]如果与预定参考值相比凝血时间延长，并且相对最大反应速度v
max rel
和/或相对最大反应加速度a
max rel
在预定狼疮抗凝物特异性值范围内，则最终检测到狼疮抗凝物。
[0021]患者的血浆样品优选是人的低血小板计数血浆样品。优选地，该低血小板计数血浆样品获得自柠檬酸化的全血。
[0022]APTT(活化的部分凝血活酶时间)是检查固有凝血系统的测试。添加到待测试样品中的APTT试剂通常包含磷脂(“部分凝血活酶”)、表面活性物质(所谓的“接触活化剂”)，诸如鞣花酸、高岭土或二氧化硅以及任选地钙离子。与狼疮抗凝物不敏感性APTT试剂相比，狼疮抗凝物敏感性APTT试剂通常包含降低浓度的磷脂，这意味着与正常(无狼疮抗凝物)样品相比，使用这种试剂测量含有狼疮抗凝物的样品的凝血时间导致延长的凝血时间。狼疮抗凝物敏感性APTT试剂可以包含另外的组分，诸如某些二价金属离子产生物质，这些物质促进凝血时间
‑
延长作用的作用(例如，参见EP 3076178 A1)。可替代地，可以在单独的试剂中提供钙离子，除了狼疮抗凝物敏感性APTT试剂之外，将该试剂添加到待测试的样品中。添加钙离子开始反应混合物中的凝血反应。
[0023]测量反应混合物随时间(t)测量变量S，得到时间依赖性测量变量的函数S(t)，通常从添加钙离子开始，或者在添加钙离子之后立即或之后不久开始。
[0024]例如，作为凝血反应的结果随时间改变的反应混合物的典型测量变量S是作为反应混合物中纤维蛋白形成的结果的反应混合物的浊度或粘度，并且它们可以借助光学或机械方法定量测定。在某个时段上测量变量的连续测定得到时间依赖性测量值的函数S(t)，即反应曲线。根据测量变量的性质，测量变量可与凝血反应成比例或反比例地改变。
[0025]反应混合物的凝血时间的确定可以用任何常规的评估方法进行。通常，术语“凝血时间”应理解为意指从凝血反应开始，通过向样品中添加相关试剂直到纤维蛋白凝块的有形形成(以秒计)的时间范围(跨度，span)。凝血时间优选基于反应曲线和合适的评估方法来确定。
[0026]将针对该样品或反应混合物确定的凝血时间与预定参考值进行比较，这将正常凝血时间与延长的凝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于在患者的血浆样品中检测狼疮抗凝物的方法，所述方法包括以下步骤：通过向所述血浆样品中添加狼疮抗凝物敏感性APTT试剂提供反应混合物，并开始凝血反应，测量所述反应混合物随时间的测量变量S，得到时间依赖性测量值的函数S(t)，以及确定凝血时间，其特征在于，另外地，a)确定函数S(t)的最大反应速度v
max
和/或最大反应加速度a
max
，以及b)确定测量开始时的第一测量值SB与测量结束时的第二测量值SE之间的差值的绝对值(|ΔS|)，并且然后c)分别使用以下公式确定相对最大反应速度v
maxrel
和/或相对最大反应加速度a
maxrel
：v
maxrel
＝v
max
/|ΔS|，以及a
maxrel
＝a
max
/|ΔS|，如果与预定参考值相比所述凝血时间延长，并且所述相对最大反应速度v
maxrel
和/或所述相对最大反应加速度a
maxrel
在预定狼疮抗凝物特异性值范围内，则检测到狼疮抗凝物。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述狼疮抗凝物敏感性APTT试剂包含磷脂、接触活化剂以及任选地钙离子。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述最大反应速度v
max
对应于所述时间依赖性测量值的函数S(t)的一阶导数的最大值或最小值。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述最大反应加速度a
max
对应于所述时间依赖性测量值的函数S(t)的二阶导数的最大值或最小值。5.一种自动分析仪，包括：(i)一个或多个移液装置，用于将样品体积和至少一个试剂体积转移到用于制备反应混合物的反应容器...

【专利技术属性】
技术研发人员：诺贝特，
申请(专利权)人：德国西门子医学诊断产品有限公司，
类型：发明
国别省市：