一种同时分离纯化制备5种稻曲菌毒素的方法技术

本发明专利技术涉及一种同时分离纯化制备5种稻曲菌毒素的方法。本发明专利技术以水稻稻曲病菌产生的稻曲球整球或者稻曲病菌产生的稻曲球孢子粉为原料，以水作为提取溶剂，精细树脂进行柱层析分离，采用固相萃取技术做为富集净化方法，采用半制备型高效液相色谱进行制备收集，液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种同时分离纯化制备5种稻曲菌毒素的方法


[0001]本专利技术涉及一种稻曲菌毒素的分离纯化制备方法，特别是涉及一种同时分离纯化制备5种稻曲菌毒素的工艺技术方法。

技术介绍

[0002]稻曲菌毒素(Ustiloxins)是由水稻稻曲病菌Ustilaginodea virens(Cooke) Takahashi产生的一种真菌毒素，是一系列的杂环肽类化合物，目前已分离出7 种结构相近的稻曲菌毒素，主要为稻曲菌毒素Ustiloxins A、Ustiloxins B、Ustiloxins C、Ustiloxins D、Ustiloxins E、Ustiloxins F和Ustiloxins G。其中稻曲菌毒素Ustiloxins E和Ustiloxins G含量极微，因此有关稻曲菌毒素的研究主要针对的是Ustiloxins A、Ustiloxins B、Ustiloxins C、Ustiloxins D和Ustiloxins F 5种稻曲菌毒素。自80年代以来，由稻曲菌引发的稻曲病已成为稻米生产中的主要病害，现已广泛分布于世界各水稻栽培区，其中较为严重的国家有日本、中国、美国、印度和菲律宾等。我国每年稻曲病的发生面积约有300万hm2，而且呈现不断加重趋势，不仅严重影响了我国稻米的产量，也已经成为稻米质量安全的主要影响因素之一，同时由于目前人们对稻曲菌毒素研究与认知的局限性，也引起了广大种植户的恐慌。
[0003]近年来随着稻曲病发生率的加剧，稻曲菌毒素的研究也引起了越来越多学者的关注，大多集中于植物保护、作物栽培、环境科学和遗传育种等学科领域。目前，稻曲菌毒素对植物的毒性是被广泛认可的，它可以抑制植物细胞的有丝分裂进而引起水稻幼苗根部和胚芽的异常肿胀，主要机制是毒素抑制细胞微管蛋白的聚合，干扰细胞骨架的形成进而造成细胞有丝分裂进程的停滞。然而有关稻曲菌毒素对人体健康方面的影响却知之甚少，仅见早期极少粗浅的报道，发现不论是将稻曲球磨成粉掺入饲料中饲喂动物(鸡、兔及大小鼠)还是将稻曲球水提液腹腔注射，即便是极低的含量也会引起动物慢性中毒及内脏病变，其中心脏、肺部表面会有出血点并出现结节，肝、肾出现严重坏死，胃部出现溃疡及严重腐蚀，甚至还存在遗传毒性，影响子代发育。而且这些研究都主要采用的是整粒的稻曲球，或者是稻曲球的粗提液，这是一个非常复杂的样品体系，除去稻曲菌毒素还有大量杂质，且相关文献年代久远，无法系统性的体现稻曲菌毒素的毒性，个别研究仅涉及稻曲菌毒素A单体化合物，至今有关稻曲菌毒素对人体健康影响的研究尚未有大的突破与进展。
[0004]“民以食为天，食以安为先。”食品安全是关系人民群众身体健康和生命安全的大事。近年来，新技术、新方法的应用也给食品安全带来了严峻的挑战。随着水稻新品种的推广应用、耕作方式、施肥用量、气候环境等因素的改变，稻曲病已成为水稻生产中的主要病害并且日益严重，影响稻米产量的同时更是直接影响着稻米的质量安全。我国作为世界第一粮食生产及消费大国，稻米的年产量约占全国粮食总产量的50％，同时也是我国大部分地区人民的主食，稻米的品质及质量安全对于消费者的营养需求和身体健康具有重大影响。但目前人们对市场销售的稻米及其相关制品中稻曲菌毒素的污染情况尚未可知。将稻曲菌毒素纳入稻米及制品质量安全指标已刻不容缓，国家政府部门也越来越关注稻米中稻
曲菌毒素的污染问题。2020年我国农业农村部最新出台了有关稻曲菌毒素的质量安全检测控制方法标准，但由于缺乏稻曲菌毒素的标准样品的商品化供给，该方法标准的实际应用受到了很大的限制，很多稻米及制品无法进行稻曲菌毒素的分析与质量控制，具有很大的安全隐患。
[0005]无论是稻曲菌毒素对人体健康影响研究进程缓慢，还是我国新出台的有关稻曲菌毒素的质量安全检测控制方法标准实际应用的受限，究其根本原因，主要是稻曲菌毒素单体化合物难以获得。稻曲菌毒素的支链上均含有羧基和氨基，具有高度的亲水性及两性特点，它作为一种两性化合物容易在较宽的PH范围内发生电离，采用传统的纯化方法具有较大的难度，因而稻曲菌毒素各个单体化合物的获得非常困难。目前有关稻曲菌毒素的分离提取及纯化制备工艺研究鲜少报道. 查阅相关文献，主要是早年日本东京大学Kobayashi博士以及江苏省农业科学院祭芳老师进行过稻曲菌毒素的分离纯化制备研究，Kobayashi博士的方法主要采用的是反相硅胶、树脂和正相硅胶结合，多次反复纯化，工艺非常繁琐；祭芳老师进行的稻曲菌毒素的分离纯化制备研究仅是针对单一的稻曲菌毒素UstiloxinA，而且两者的分离纯化制备方法都用到了二氯甲烷有机溶剂，给环境污染以及操作人员身体健康都带来了很大的危害。另外，从合成角度来看，由于稻曲菌毒素的闭环结构特点，其合成工艺步骤多达二十几步，且得率非常低。种种原因限制，目前稻曲菌毒素各种单体化合物并无市场化的供应。而高纯度的稻曲菌毒素各单体化合物的获得是稻曲菌毒素研究及应用的前提和基础，也是目前限制稻曲菌毒素深入研究和应用的最大瓶颈问题，亟待解决。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于：针对目前并无市场化的稻曲菌毒素单体化合物供应，从而限制了人们对稻曲菌毒素的深入研究以及对稻米质量安全的风险控制工作的开展等问题，本专利技术提供一种同时分离纯化制备5种稻曲菌毒素的技术方法，突破性解决目前限制水稻稻曲病菌毒素深入研究的关键瓶颈问题，可为今后有关稻曲菌毒素对人体健康影响、稻米质量安全风险监测、暴露评估以及稻米中稻曲菌毒素限量标准的研究与制定提供必要前提和基础。
[0007]本专利技术所采用的具体技术方案如下：
[0008]一种同时分离纯化制备5种稻曲菌毒素的方法，其包括如下步骤：
[0009]S1、以稻曲球整球或者稻曲球孢子粉为原料，以水作为提取溶液对原料进行匀浆破碎、震荡提取和离心分离，获得的上清液经过真空冷冻干燥得到稻曲菌毒素的粗提物；
[0010]S2、采用精细树脂HP20SS作为柱层析的填料按湿法装柱方式填入耐有机中压层析柱中，将耐有机中压层析柱安装于高效液相色谱仪的色谱柱位置，采用高效液相色谱仪作为输液系统，对层析柱进行压柱；
[0011]S3、将粗提物用水溶解后离心，获取的上清液过膜滤去杂质后，上层析柱进行柱层析分离；
[0012]S4、采用高效液相色谱仪作为输液系统进行稻曲菌毒素目标化合物的洗脱，洗脱溶液为甲醇
‑
水体系，洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱中流动相比例由5％梯度升至25％，洗脱液使用全自动部分收集器逐管收集；
[0013]S5、对收集的洗脱液中的稻曲菌毒素类型进行追踪鉴定，合并属于同一类稻曲菌
毒素的洗脱液，再分别对合并后的5种洗脱液进行真空离心浓缩，得到 Ustiloxin A、Ustiloxin B、Ustiloxin C、Ustiloxin D和Ustiloxin F 5种稻曲菌毒素的柱层析分离提取物；
[0014]S6、对5种稻曲菌毒素的柱层析分离提取物通过固相萃取技术进行富集净化后再进一步纯化，最终得到Ustiloxin A、Ustiloxi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时分离纯化制备5种稻曲菌毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、以稻曲球整球或者稻曲球孢子粉为原料，以水作为提取溶液对原料进行匀浆破碎、震荡提取和离心分离，获得的上清液经过真空冷冻干燥得到稻曲菌毒素的粗提物；S2、采用精细树脂HP20SS作为柱层析的填料按湿法装柱方式填入耐有机中压层析柱中，将耐有机中压层析柱安装于高效液相色谱仪的色谱柱位置，采用高效液相色谱仪作为输液系统，对层析柱进行压柱；S3、将粗提物用水溶解后离心，获取的上清液过膜滤去杂质后，上层析柱进行柱层析分离；S4、采用高效液相色谱仪作为输液系统进行稻曲菌毒素目标化合物的洗脱，洗脱溶液为甲醇
‑
水体系，洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱中流动相比例由5％梯度升至25％，洗脱液使用全自动部分收集器逐管收集；S5、对收集的洗脱液中的稻曲菌毒素类型进行追踪鉴定，合并属于同一类稻曲菌毒素的洗脱液，再分别对合并后的5种洗脱液进行真空离心浓缩，得到Ustiloxin A、Ustiloxin B、Ustiloxin C、Ustiloxin D和Ustiloxin F 5种稻曲菌毒素的柱层析分离提取物；S6、对5种稻曲菌毒素的柱层析分离提取物通过固相萃取技术进行富集净化后再进一步纯化，最终得到Ustiloxin A、Ustiloxin B、Ustiloxin C、Ustiloxin D和Ustiloxin F 5种稻曲菌毒素的纯化物。2.如权利要求1所述的同时分离纯化制备5种稻曲菌毒素的方法，其特征在于，所述S6中，所述富集净化的方式是：将5种稻曲菌毒素的柱层析分离提取物各自通过固相萃取柱进行固相萃取，得Ustiloxin A、Ustiloxin B、Ustiloxin C、Ustiloxin D和Ustiloxin F 5种稻曲菌毒素的富集净化物。3.如权利要求1所述的同时分离纯化制备5种稻曲菌毒素的方法，其特征在于，所述S6中，所述纯化的方式是：将经过富集净化得到的5种稻曲菌毒素的富集净化物，分别经制备型或半制备型高效液相色谱进一步分离制备，液相色谱馏分收集器根据目标化合物保留时间设置自动收集，收集液经真空冷冻干燥，最终分别得到含量均大于90％的5种稻曲菌毒素单体化合物Ustiloxin A、Ustiloxin B、Ustiloxin C、Ustiloxin D和Ustiloxin F纯化物。4.根据权利要求1所述的同时分离纯化制备5种稻曲菌毒素的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙丽华，张国梅，李晗，刘珊珊，周许茗，陆明旸，唐靓，
申请(专利权)人：杭州医学院，
类型：发明
国别省市：