【技术实现步骤摘要】
氯硝柳胺对细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法
[0001]本专利技术属于医疗
，尤其涉及一种PI3K
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AKT信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法。
技术介绍
[0002]氯硝柳胺长期被作为一种驱虫剂，用于治疗绦虫感染约已有50余年历史。人们发现，氯硝柳胺具有更为广泛的药理活性，可以调节糖尿病和糖尿病肾病，改善树突状细胞功能，抑制寨卡病毒复制，改善关节炎症，预防系统性硬化症等多种药理作用。氯硝柳胺也是一种有效的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) 抑制剂，可作为潜在的抗糖尿病药物。近年来，一系列研究表明氯硝柳胺显示出抗癌活性，如胶质母细胞瘤、卵巢癌、急性髓细胞白血病、肺癌、乳腺癌，但氯硝柳胺对结肠癌的抗癌活性未见相关文献报道。多项研究表明，氯硝柳胺可通过多种信号通路发挥抗肿瘤作用，如Wnt/β
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连环蛋白、STAT3和Notch[13] 等信号通路。以上研究表明，氯硝柳胺是一种潜在的抗癌药物。氯硝柳胺作为一种传统老药，可能具有多种新用途，它作为一种抗肿瘤药...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种PI3K
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AKT信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法，其特征在于，所述PI3K
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AKT信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法包括以下步骤：步骤一，对结肠癌细胞进行分离及培养；步骤二，用MTT实验法检测氯硝柳胺对结肠癌细胞的增殖抑制作用；步骤三，通过流式细胞术检测氯硝柳胺对结肠癌细胞周期的抑制作用；步骤四，通过DAPI荧光染色法观察氯硝柳胺对结肠癌细胞凋亡的诱导作用；步骤五，通过用实时定量PCR技术检测氯硝柳胺对结肠癌细胞PI3K/AKT通路相关基因mRNA的表达变化；步骤六，通过用Western Blot技术分析氯硝柳胺对结肠癌细胞PI3K/AKT通路相关蛋白的表达变化情况。2.如权利要求1所述的PI3K
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AKT信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法，其特征在于，所述对结肠癌细胞进行分离及培养方法如下：(1)按重量份数据将二甲基亚砜1份、乙酰胺2份、葡萄糖5份、磷酸二氢钠3份、枸橼酸钠2份、枸橼酸钾3份、硫酸镁4份、腺嘌呤核苷1份、左旋精氨酸2份进行搅拌混合，获得保存液，无菌条件下切取新鲜结肠癌组织放入保存液进行保存，5℃密封运回实验室；将组织处理器械浸泡于浓度76％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；(2)将组织放入预冷无菌含双抗PBS液中，培养皿置于冰上洗涤除去表面的系膜、血管、脂肪、坏死组织，无菌条件下在预冷的PBS中用眼科剪将结肠癌组织剪成1mm
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1mm
×
1mm的碎块；(3)用38℃预热的胰蛋白酶
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EDTA消化液和胶原酶分别消化；用含胎牛血清、双抗、胰岛素的混合培养基终止消化，所得滤液356g离心6min，去掉上清液，保留沉淀，重复两次；取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；(4)加入完全培养基重悬，细胞计数板计数；细胞计数后接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的培养瓶中，置于38℃、6％CO2环境中继续培养，每4d换一次液；(5)细胞纯化，酶消化法；细胞传代培养；细胞形态及生长情况观察。3.如权利要求1所述的PI3K
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AKT信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法，其特征在于，所述用预冷的PBS浓度为0.02M，PH为7.5。4.如权利要求1所述的PI3K
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AKT信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法，其特征在于，所述消化环境为38℃，6％CO2培养箱，用0.4％的胰蛋白酶消化16min，再用0.3％的iv型胶原酶消化5h。5.如权利要求1所述的PI3K
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AKT信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法，其特征在于，所述0.26％的胰蛋白酶消化液消化11min，再用含0.2％的iv型胶原酶消化3.6min。6.如权利要求1所述的PI3K
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AKT信号通路介导氯硝柳胺对结肠癌细胞周期阻滞和凋亡诱导作用的测定方法，其特征在于，所述MTT实验法检测方法如下：1)活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将外源性3
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(4，5
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二甲基噻唑
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2)
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2，5
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二苯基四氮唑溴盐(MTT)还原为不溶性甲瓒，而死细胞无此功能；
2)二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臜，570nm)测定其光吸收值，其吸光度值与活细胞数成正比，据此可测出药物处理后的细胞存活率；3)将处于对数生长期不同结肠癌细胞接种于96孔板中，分别用不同浓度氯硝柳胺进行处理，每组设5个复孔；4)培养72h后，每孔...
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