一种紫贻贝原代血细胞的培养方法技术

本发明专利技术属于细胞培养技术领域，具体涉及一种紫贻贝原代血细胞的培养方法。所述方法包括以下步骤：(1)提取紫贻贝血淋巴；(2)将步骤(1)中得到的血淋巴分离为血细胞和血淋巴上清液；(3)将所述血淋巴上清液制备为血细胞培养液；(4)用步骤(3)制备的血细胞培养液将步骤(2)中得到的血细胞重悬，得到血细胞悬液；(5)利用血细胞悬液进行血细胞培养。应用本发明专利技术方法进行的紫贻贝原代血细胞培养，培养48h内的血细胞密度与初始密度持平，并且细胞状态稳定、形态良好，有效解决了血细胞凝结和形变的问题，为相关贝类免疫学与生态毒理学研究提供了细胞工具和支撑。工具和支撑。工具和支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种紫贻贝原代血细胞的培养方法


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种紫贻贝原代血细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]近年来，近海生态环境的恶化，不仅对贝类食品安全构成了严重威胁，还通过影响免疫功能及基础代谢造成了贝类的生理过程紊乱，严重制约了贝类养殖产业的健康发展。贻贝在世界贝类养殖中具有重要地位， 2019年全球贻贝养殖产量20.69
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105t，占贝类养殖总产量的12％，其中紫贻贝(Mytilus edulis)产量约占贻贝总产量的58％。更重要的是，贻贝为营固着的滤食性生物，对环境污染的规避能力弱、蓄积能力强，加之其广泛的地理分布，因此常被作为灵敏指示近海环境变化的岗哨生物，用以监测近海环境污染状况。
[0003]贝类免疫系统是生物体抵御外源胁迫的第一道屏障，血淋巴中的血细胞是其免疫功能的主要承担者。血细胞具有吞噬和包囊作用，可清除病原生物和自身损伤或死亡细胞，同时对机体的炎症、伤口进行修复，在宿主免疫防御机制中起着重要作用。由于贝类是开放式循环系统，血细胞更易接触环境中的有害物质而产生免疫毒性，因此血细胞被认为是外源物质攻击的关键“靶器官”，具有潜力作为细胞免疫学与生态毒理学的重要研究模型。然而，由于贝类血细胞的细胞形态、生理结构、功能分化、营养需求等方面的特殊性，至今还没有建立起成熟永生细胞系，原代细胞培养仍然是主要依托的方法。但是，即使是原代细胞培养，目前可参考的、认可度高的培养技术仍十分有限，严重限制了相关贝类免疫学与生态毒理学研究的深入开展。

技术实现思路

[0004]针对上述技术问题，本专利技术目的提供一种紫贻贝原代血细胞的培养方法，该方法对后续在细胞层面开展相关理论研究提供了技术支持。
[0005]为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0006]本专利技术提供一种紫贻贝原代血细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0007](1)提取紫贻贝血淋巴；
[0008](2)将步骤(1)中得到的血淋巴分离为血细胞和血淋巴上清液；
[0009](3)将所述血淋巴上清液制备为血细胞培养液；
[0010](4)用步骤(3)制备的血细胞培养液将步骤(2)中得到的血细胞重悬，得到血细胞悬液；
[0011](5)利用血细胞悬液进行血细胞培养。
[0012]在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(1) 在无菌条件下进行；优选地，步骤(1)中使用无菌针管提取血淋巴；优选地，所述无菌针管中吸有抗凝剂；优选地，所述抗凝剂的有效成分为柠檬酸钠；优选地，所述抗凝剂为阿氏液；优选地，所述抗凝剂与所述血淋巴的体积比为1:(8～10)，更优选的体积比为1：9。
[0013]在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(1) 中所
述紫贻贝为生长状态良好的成年紫贻贝；优选地，所述紫贻贝壳长5
±
0.5cm；优选地，所述紫贻贝为经实验室条件驯化至少一周的成年紫贻贝；优选地，所述紫贻贝在水环境中饥饿处理16～32h后再进行血淋巴的提取，更优选为24h。
[0014]本专利技术中选取生长状态良好的成年紫贻贝用于提取血淋巴，选取标准为外壳紧闭，附着足丝强健有力，养殖水体清澈的成年紫贻贝。在提取血淋巴前对紫贻贝进行饥饿处理是为了让紫贻贝将摄食的小球藻代谢掉，避免提取血淋巴的过程中吸入残留在体内的小球藻。饥饿时间过短，提取血淋巴时易吸入小球藻，饥饿时间过长则会影响紫贻贝的生长状态。
[0015]在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，所述实验室条件驯化为：将成年紫贻贝在海水温度为18
±
2℃、盐度为31
±1‰
、pH为8.1
ꢀ±
0.1的实验室条件下驯化两周，期间每日更换新鲜海水，并投喂小球藻，所述小球藻在所述海水中的浓度为1.5
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105cells/mL。
[0016]本专利技术在提取血淋巴步骤前对野外养殖的贻贝进行驯化，能够使其适应实验室条件、保持稳定的个体生长状态，以降低所提取的血淋巴的个体差异性。本专利技术优选实施方式中小球藻的投喂量模拟了海域中的充足食物量的环境，有利于紫贻贝在驯化过程中保持良好的生长状态。本专利技术步骤(1)中所述的血淋巴提取方法，可以采用本领域常规方法，也可以参照专利No：CN204705520U，采用其中紫贻贝后闭壳肌穿刺取血装置从闭壳肌穿刺取血，具体可以参见该篇文献说明书中记载的后闭壳肌穿刺取血方法步骤。
[0017]在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(2) 中，将所提取的全部血淋巴混合均匀后再进行分离。
[0018]本专利技术的优选实施方式中，将多个紫贻贝中提取的血淋巴混合均匀后再进行分离，可以降低个体差异性的影响。
[0019]在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(2) 中的分离方法为离心，离心所得上清为血淋巴上清液，离心所得沉淀为血细胞；优选地，所述离心的温度为14～16℃，更优选为15℃；优选地，所述离心的离心力为380～420g，更优选为400g。
[0020]在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(3) 中对所述血淋巴上清液进行除菌处理，然后加入抗生素，制得所述血细胞培养液；优选地，所述除菌处理为过膜除菌；更优选的，过膜除菌所用的滤膜为0.22μm 的无菌滤膜；优选地，所述抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素；优选地，所述抗生素在血细胞培养液中的浓度为：青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml、庆大霉素50μg/ml、卡那霉素100μg/ml。
[0021]在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(4) 还包括对所得血细胞悬液进行过滤；优选地，步骤(4)中，使用筛绢对所述血细胞悬液进行过滤；优选地，所述筛绢的规格为400目。
[0022]本专利技术的优选实施方式中，使用400目的筛绢对血细胞悬液进行过滤，400 目的筛绢孔径略大于血细胞粒径，可以使单个的血细胞通过，同时能够有效去除凝结的细胞团。使用筛绢进行过滤，不仅对血细胞的伤害小，还具有操作简单便捷、过滤效率高的优势。
[0023]在上述紫贻贝原代血细胞的培养方法中，作为一种优选实施方式，步骤(5) 中，使用所述血淋巴上清液将步骤(4)得到的血细胞悬液稀释至(2.5～7.5)
×ꢀ
105cells/mL再进
行培养，更优选为5
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105cells/mL；步骤(5)中所述血细胞培养为将稀释后的所述血细胞悬液接种至细胞培养板中，置于无菌培养箱进行培养；优选地，所述细胞培养板为六孔细胞培养板；优选地，所述培养箱的培养条件为温度：15℃、相对湿度：40％。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：相对于现有技术，本专利技术紫贻贝原代血细胞培养方法，能够有效解决血细胞凝结和形变的问题，培养得到的细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取紫贻贝血淋巴；(2)将步骤(1)中得到的血淋巴分离为血细胞和血淋巴上清液；(3)将所述血淋巴上清液制备为血细胞培养液；(4)用步骤(3)制备的血细胞培养液将步骤(2)中得到的血细胞重悬，得到血细胞悬液；(5)利用血细胞悬液进行血细胞培养。2.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)在无菌条件下进行；优选地，步骤(1)中使用无菌针管提取血淋巴；优选地，所述无菌针管中吸有抗凝剂；优选地，所述抗凝剂的有效成分为柠檬酸钠；优选地，所述抗凝剂为阿氏液；优选地，所述抗凝剂与所述血淋巴的体积比为1:(8～10)，更优选的体积比为1：9。3.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述紫贻贝为生长状态良好的成年紫贻贝；优选地，所述紫贻贝壳长5
±
0.5cm；优选地，所述紫贻贝为经实验室条件驯化至少一周的成年紫贻贝；优选地，所述紫贻贝在水环境中饥饿处理16～32h后再进行血淋巴的提取，更优选为24h。4.如权利要求3所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，所述实验室条件驯化为：将成年紫贻贝在海水温度为18
±
2℃、盐度为31
±1‰
、pH为8.1
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0.1的实验室条件下驯化两周，期间每日更换新鲜海水，并投喂小球藻，所述小球藻在所述海水中的浓度为1.5
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105cells/mL。5.如权利要求1所述的紫贻贝原代血细胞的培养方法，其特征在于，步骤(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王悠，张亚亚，姜永顺，李媛媛，曹赛，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：