一株产蛋白酶的菌株及其应用制造技术

一株产蛋白酶的菌株及其应用，涉及产蛋白酶的菌株及其应用。本发明专利技术产蛋白酶的菌株为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)XCR

【技术实现步骤摘要】
一株产蛋白酶的菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及产蛋白酶的菌株及其应用。

技术介绍

[0002]目前文献报道的具有产蛋白酶的细菌有芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、变形杆菌属(Proteus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、小球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、八叠球菌属(Sporosarcina)、无色杆菌属(Achromobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、黄杆菌属(Flavobacterium)、赛氏杆菌属(Serratia)、肠细菌属(Enterobacter)以及埃希氏杆菌属(Esche richia)等。但尚未有赖氨酸芽孢杆菌产蛋白酶的报道。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一株产蛋白酶的菌株及其应用。
[0004]本专利技术产蛋白酶的菌株为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)XCR
‑
3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.24196。
[0005]本专利技术上述产蛋白酶的菌株在鱼类养殖中的用途。
[0006]本专利技术纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)XCR
‑
3菌落为圆形，无色透明状，边缘整齐，中间突起，呈黏性，经革兰氏染色为革兰氏阳性菌。在37℃培养环境中DDP
‑
IV抑制剂产率高达64.86％；在37℃条件下本专利技术纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)XCR
‑
3在胆盐浓度为0.6％的环境中存活率仍保持为85％。
[0007]本专利技术纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)XCR
‑
3可用于鱼类养殖，能够显著提升饲料的利用率，提高增重率。
[0008]纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)XCR
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3为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，属于赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24196，保藏日期为2021年12月27日。
附图说明
[0009]图1是具体实施方式一中梯度稀释的菌株在2％脱脂奶粉培养基上的乳蛋白水解圈照片；
[0010]图2是由具体实施方式一中蛋白酶活力最高的菌株XCR
‑
3构建的系统发育树。
具体实施方式
[0011]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0012]需要说明的是，在不冲突的情况下，本专利技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0013]具体实施方式一：本实施方式产蛋白酶的菌株为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis)XCR
‑
3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.24196。
[0014]2021年9月，选取黑龙江省鸡西市密山市兴凯湖区养殖的鲤，将鲤肠道内含物置于含玻璃珠和50mL无菌水的锥形瓶中，以180r/min的转速室温振荡30min，再进行梯度稀释，将10
‑3、10
‑4、10
‑5梯度取100μL涂布于2％脱脂奶粉培养基平板上，每个梯度重复3次，置于28℃培养24～48h。采用乳蛋白水解圈的方法进行筛选，挑取产生透明圈的菌株进行纯化。然后，对菌株进行蛋白酶活性的检测，采用Folin酚法：(1)将细菌分离物接种到产蛋白酶细菌发酵培养基中，置于37℃恒温摇床以180r/min转速震荡培养48h；(2)将发酵液于40℃的水浴锅中预热2min。吸取预热好过的发酵液1mL于试管，加入同样预热的2％酪蛋白溶液1mL，精确保温10min；(3)立即加入0.4mol三氯乙酸2mL，终止反应；(4)继续水浴20min，使残余蛋白质充分沉淀后，以10000r/min的转速离心5min。对照在加入酪蛋白溶液前加入三氯乙酸进行灭活；(5)取上清1mL，加入0.4mol/L的Na2CO
3 5mL，福林试剂1mL，震荡摇匀，40℃保温发色20min后测在波长660nm处的吸光值。(6)根据酪氨酸标准曲线，计算蛋白酶活力。在此反应条件下定义：每1min生成1μg酪氨酸所需酶量定义为一个酶活(U)。
[0015]挑选蛋白酶活力最高的菌株(XCR
‑
3，XCR
‑
3的蛋白酶活力高达107U)进行鉴定：
[0016]菌株XCR
‑
3的16S rRNA鉴定：采用北京索莱宝生物科技公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，提取分离纯化后的菌株DNA。采用细菌通用引物27F/1492R进行PCR扩增，PCR扩增体系为25μL体系：10
×
缓冲液2.5μL、Taq酶0.5μL、dNTPs 2μL、引物27F 0.5μL、引物1492R0.5μL、DNA模板1μL、ddH2O 18μL。PCR扩增反应程序设定为：95℃预变性5min；94℃变性50s、56℃退火30s、72℃延伸1.5min，循环次数30次；72℃再延伸10min，4℃保存。将PCR扩增产物送往RuiBiotech公司测序，菌株XCR
‑
3的16S rRNA与纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)(FN433012.1)相似度为99％。通过NCBI数据库比对菌株16SrRNA的测序结果，并构建系统进化树(如图2所示)。由图2菌株XCR
‑
3的系统发育树可以看出菌株XCR
‑
3与纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)(FN433012.1)同处最小的一个分支，进化距离较近。
[0017]菌株XCR
‑
3的生理生化鉴定：将菌株XCR
‑
3在固体LB培养基平板上三区划线，分离出单菌落并对其形态进行描述，根据《常用细菌系统鉴定手册》对菌株进行革兰氏染色以及生理生化鉴定。菌株XCR
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3菌落为圆形，无色透明状，边缘整齐，中间突起，呈黏性，经革兰氏染色为革兰氏阳性菌。菌株XCR
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3的部分生理生化指标如表1所示。
[0018]表1
[0019][0020]菌株XCR
‑
3与纺锤形赖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产蛋白酶的菌株，其为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)XCR
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3，保藏在中...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝其睿，何海龙，葛一笑，覃东立，汤施展，李林原，夏邦华，杜宁宁，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：