一种土壤中抗生素产生菌及其筛选、鉴定方法技术

本发明专利技术涉及抗生素提取技术领域，尤其涉及一种土壤中抗生素产生菌及其筛选、鉴定方法。通过将土壤样品的制备，抗生素产生菌的筛选与纯化，再通过抗菌谱测定、16srDNA/18srDNA扩增子测序，可快速实现土壤中抗生素产生菌的筛选与鉴定。本发明专利技术从土壤中筛选得到的抗生素产生菌分别为红青霉、杂色曲霉、委内瑞拉链霉菌、山丘链霉菌、墨西哥链霉菌、华丽黄链霉菌、溶藻链霉菌，试验结果表明对部分细菌有很好的抑制作用。本发明专利技术中抗生素产生菌筛选、鉴定方法具有低毒性、高效性、无污染性的特点，通过本方法筛选得到的菌株为下一步研究菌株的生产性能和新药剂的开发创造了条件，同时对未来抗生素的生产提供了新资源和新思路，在医药、农业行业具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种土壤中抗生素产生菌及其筛选、鉴定方法


[0001]本专利技术涉及抗生素提取
，尤其涉及一种土壤中抗生素产生菌及其筛选、鉴定方法。

技术介绍

[0002]一直以来，植物病害成为威胁农作物产量的潜在因素。不仅会影响农作物的产量，降低其品质，严重时会导致颗粒无收，给农民带来巨大损失，而且也不利于农产品的储藏、加工和运输。目前，化学农药是防治植物病虫害的一种有效方法，但化学农药含各种化学试剂，对植物本身的危害、对人和动物食用后的食品安全隐患以及在使用过程中造成的环境污染问题仍难以解决。再者，随着生活水平的提高，人们对“绿色无公害食品”的要求越来越高，需求量越来越大，因此新型高效低毒农用抗生素的开发势在必行。
[0003]生物方法相对于化学方法具有低毒性、高效性，无污染性，而且生物农药的选择性强、安全性高，所以生物学方法的开发和应用是未来农业病害防治的趋势，也将受到世界各国越来越多的重视。土壤中含有丰富的微生物资源，这些微生物能产生抗生素、抗真菌剂和免疫抑制剂等多种有用的次级代谢物，放线菌群或少部分丝状真菌是它们的主要来源。然而，生活中利用的抗生素大多是由抗生素产生的，筛选出来的放线菌却很少，据报道仅有0.1％～0.5％，因此开展抗生素产生菌的研究为大势所趋。
[0004]有鉴于此，针对以上现有技术的不足，本专利技术提供一种土壤中抗生素产生菌及其筛选、鉴定方法，筛选得到的抗生素产生菌对细菌有很好的抑制作用，且该筛选、鉴定方法相对于化学方法具有低毒性、高效性、无污染性的特点。

技术实现思路
/>[0005](1)要解决的技术问题
[0006]本专利技术的目的在于提供一种土壤中抗生素产生菌的筛选、鉴定方法，以解决现有技术中抗生素毒性大、污染大、难于储藏、加工和运输困难的问题。
[0007](2)技术方案
[0008]为了解决上述问题，本专利技术一方面提供了一种土壤中抗生素产生菌的筛选、鉴定方法，其包括以下步骤：
[0009]S1、培养基配制：配制高氏一号培养基、LB固体培养基；
[0010]S2、取样：采用五点交叉取样法在营养丰富的土壤中取样；
[0011]S3、制样：称取定量的土壤样品于锥形瓶中，加入无菌水并摇匀，静置半分钟，以获得基础菌悬液，再取多支无菌试管，依次加入无菌水稀释、混匀，以获得不同浓度梯度的菌悬液；
[0012]S4、目的菌株的筛选分离：分别取不同浓度梯度的菌悬液分别注入多组培养皿内，待菌悬液凝固后得到多组培养平板，取S1步骤中的高氏一号培养基，在微波炉中加热使其融化，待其冷却后分别倒入多组培养平板中，微微晃动，使菌落分散均匀，待其凝固后将培
养平板倒扣在恒温箱中培养7天；
[0013]S5、目的菌株的纯化：挑去培养平板上质地紧密、表面呈绒状的菌落，或干燥、褶皱、较小的单菌落，以实现培养平板的除杂，再将除杂后培养平板中的菌落接种于高氏一号培养基上进行分离纯化，在培养箱中培养7天，以获得抗生素产生菌。
[0014]S6、目的菌株的鉴定：目的菌株的鉴定：将步骤S5培养得到的抗生素产生菌依次进行测定、测序，以鉴定抗生素产生菌的类型。
[0015]进一步地，步骤S1中，高氏一号培养基的组成为：可溶性淀粉为20g/L、KNO3为1g/L、NaCl为0.5g/L、K2HPO4为0.5g/L、MgSO4为0.5g/L、FeSO4为0.01g/L、琼脂15g/L。
[0016]进一步地，步骤S2中，土壤取样时去除表层土壤，然后挖取深处的土壤，除去杂物，土样取回后立即进行实验。
[0017]进一步地，步骤S3中，所述基础菌悬液的浓度为10
‑2g/L，不同浓度梯度的菌悬液的浓度分别为10
‑3g/L、10
‑4g/L、10
‑5g/L、10
‑6g/L。
[0018]进一步地，步骤S4中，所述冷却的温度为45℃～50℃，所述恒温箱的温度为28℃。
[0019]进一步地，步骤S5中，所述培养箱的温度为28℃。
[0020]进一步地，步骤S6中，所述测定为抗菌谱测定，具体为将LB固体培养基加热、冷却至室温后进行倒平板，待平板冷凝后将指示菌涂布在培养基上，再取适量的步骤S5得到的抗生素产生菌于平板分区的中央，培养一天后观察抑菌圈形成情况。
[0021]进一步地，所述测序为16srDNA/18srDNA扩增子测序，包括依次进行抗生素产生菌DNA基因提取、PCR扩增反应及DNA序列测试与分析。
[0022]本专利技术另一方面还提供了一种由上述筛选方法得到的抗生素产生菌。
[0023]进一步地，所述抗生素产生菌为红青霉、杂色曲霉、委内瑞拉链霉菌、山丘链霉菌、墨西哥链霉菌、华丽黄链霉菌、溶藻链霉菌中的一种或多种。
[0024](3)有益效果
[0025]综上，本专利技术上述技术方案具有如下优点：
[0026]本专利技术提供的抗生素产生菌筛选、鉴定方法中，通过将土壤样品制备、抗生素菌株筛选与纯化，再通过抗菌谱测定、16srDNA/18srDNA扩增子测序可快鉴定出菌株类别。通过抗菌活性分析证明筛选得到的抗生素产生菌对部分细菌有很好的抑制作用。本专利技术中抗生素产生菌筛选、鉴定方法具有低毒性、高效性、无污染性的特点，通过本方法筛选得到的菌株为下一步研究菌株的生产性能和新药剂开发创造了条件，同时对未来抗生素的生产提供了新资源和新思路，在医药、农业行业具有广阔的应用前景。
附图说明
[0027]图1是本专利技术实施例1筛选筛选的抗生素产生菌的菌落形态特征图。
[0028]图2是本专利技术实施例1中筛选筛选的抗生素产生菌使用引物进行16srDNA/18srDNA扩增子反应得到的产物DNA测序图。
具体实施方式
[0029]下面结合附图和实施例对本专利技术的实施方式作进一步详细描述。以下实施例的详细描述和附图用于示例性地说明本专利技术的原理，但不能用来限制本专利技术的范围，即本专利技术
不限于所描述的实施例。
[0030]本专利技术提供的一种土壤中抗生素产生菌的筛选、鉴定方法，所述方法具体包括以下步骤:
[0031]S1、培养基配制：高氏一号培养基、LB固体培养基的配制；
[0032]具体地，高氏一号培养基的组成为：可溶性淀为20g/L、KNO3为1g/L、NaCl为0.5g/L、K2HPO4为0.5g/L、MgSO4为0.5g/L、FeSO4为0.01g/L、琼脂15g/L，pH值为7.1～7.5；
[0033]LB固体培养基组成：蛋白胨10g/L、肉提取物3g/L、乳糖5g/L、溴麝香草酚蓝0.024g/L，pH值调至7.0。
[0034]S2、取样：采用五点交叉取样法在营养丰富的土壤中取样；
[0035]具体地，土壤取样时去除表层约2cm厚的土壤，然后挖取约深为2
‑
10cm处的土壤，除去杂物，土样取回后立即进行实验。
[0036]S3、制样：称取一定量的土壤样品于锥形瓶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种土壤中抗生素产生菌的筛选及鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、培养基配制：配制高氏一号培养基、LB固体培养基；S2、取样：采用五点交叉取样法在营养丰富的土壤中取样；S3、制样：称取定量的土壤样品于锥形瓶中，加入无菌水并摇匀，静置半分钟，以获得基础菌悬液，再取多支无菌试管，依次加入无菌水稀释、混匀，以获得不同浓度梯度的菌悬液；S4、目的菌株的筛选分离：分别取不同浓度梯度的菌悬液分别注入多组培养皿内，待菌悬液凝固后得到多组培养平板，取S1步骤中的高氏一号培养基，在微波炉中加热使其融化，待其冷却后分别倒入多组培养平板中，微微晃动，使菌落分散均匀，待其凝固后将培养平板倒扣在恒温箱中培养7天；S5、目的菌株的纯化：挑去培养平板上质地紧密、表面呈绒状的菌落，或干燥、褶皱、较小的单菌落，以实现培养平板的除杂；再将除杂后培养平板中的菌落接种于高氏一号培养基上进行分离纯化，在培养箱中培养7天，以获得抗生素产生菌。S6、目的菌株的鉴定：将步骤S5培养得到的抗生素产生菌依次进行测定、测序，以鉴定抗生素产生菌的类型。2.根据权利要求1所述的筛选及鉴定方法，其特征在于：步骤S1中，高氏一号培养基组成为：可溶性淀粉为20g/L、KNO3为1g/L、NaCl为0.5g/L、K2HPO4为0.5g/L、MgSO4为0.5g/L、FeSO4为0.01g/L、琼脂15g/L。3.根据权利要求1所述的筛选及鉴定方法，其特征在于：步骤S2中，土壤取样时去除表层土壤，然后挖取深处...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晶晶，高翠娟，王淑娟，薄文文，刘建阳，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：