一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用，本发明专利技术的杓兰果胶杆菌，保藏编号为CGMCC No.17442。本发明专利技术首次报道了一种产海藻糖酶的杓兰果胶杆菌，海藻糖酶酶活为19U/mL。将该海藻糖酶基因在大肠杆菌体系中异源表达，重组菌在5 L罐发酵28 h达到最高酶活2150 U/mL。重组蛋白PCTre的最适反应温度和pH分别为35

【技术实现步骤摘要】
一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用


[0001]本专利技术涉及一种海藻糖酶、重组菌及其在酵母制品水解中的应用，属于工业微生物


技术介绍

[0002]海藻糖是由两个葡萄糖分子以α,α
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1糖苷键构成的非还原性糖，性质稳定，能耐受高温。海藻糖酶(Trehalase)可将其水解为葡萄糖，在食品、农业、发酵工业等领域应用广泛。
[0003]酵母具有利用糖质原料合成海藻糖的能力，在高浓糖质底物发酵体系中酵母甚至能够合成4％以上的海藻糖，成为发酵液中残糖的主要部分，导致原料利用率下降。为此，杜邦公司在2016年推出Synerxia发酵技术体系，其核心创新是在酶制剂中加入了海藻糖酶，宣称可降低糖耗并增产乙醇2％。随后诺维信公司在2017年也推出了含海藻糖酶的全新淀粉酶产品，其目标是将二糖残留值降低达70％，此举进一步推动了海藻糖酶的应用。然而我国海藻糖酶的研究相对滞后，亟须在海藻糖酶新基因发现、高表达体系以及应用研究方面予以重视，提高产酶水平、降低生成成本、改善催化性能以更好地用于工业生产。
[0004]由于在昆虫体内，海藻糖是重要的能量物质，因此海藻糖酶及海藻糖合成酶的研究一直是昆虫代谢机制、昆虫抗逆特性研究的关注点，昆虫海藻糖酶基因位点也被作为农业杀虫剂的新靶点；而在微生态领域，由于海藻糖酶能够破坏生物膜的形成与稳定，也可以作为绿色抑菌剂成分进行使用；此外，在临床医学研究中，发现海藻糖酶的竞争性抑制剂1,5
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脱水山梨醇(1,5
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AG)是血液中能够反应血糖中长期代谢水平的关键指标，比糖化血红蛋白(HbA1c) 更为敏感，因而利用海藻糖酶开发1,5
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AG的检测试剂盒也是国际研究中的一个热点，其在临床检测领域潜力巨大。
[0005]酵母粉、酵母浸膏、酵母浸粉等酵母制品中通常含有较高的海藻糖，作为培养基用于工程菌发酵时，所含的海藻糖可干扰微生物的代谢，如果在酵母制品生产过程中，采用海藻糖酶将其转化为葡萄糖，不仅能够降低对微生物的影响、使培养过程和产物代谢更为可控，而且可以提高酵母粉的发酵利用效率。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供一株产海藻糖酶菌A4，经鉴定为杓兰果胶杆菌 (Pectobacterium cypripedii)以及表达海藻糖酶的重组菌株及应用。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一株杓兰果胶杆菌，命名为杓兰果胶杆菌 (Pectobacterium cypripedii)，于2019年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No.17442。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供一种海藻糖酶，所述海藻糖酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种编码所述的海藻糖酶的基因。
[0010]进一步地，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。
[0012]本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述的海藻糖酶的重组细胞或重组菌。
[0013]进一步地，所述的重组菌以大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母或丝状真菌为宿主。
[0014]本专利技术的第五个目的是提供所述的海藻糖酶、重组细胞或重组菌在水解酵母制品中的应用。
[0015]进一步地，所述的应用包括如下步骤：将海藻糖酶添加至酵母制品溶液中对酵母制品进行水解。
[0016]进一步地，水解的条件为：反应温度30～37℃、反应pH 5～6、酵母制品浓度1～10％，加酶量50～200U。
[0017]本专利技术的有益效果是：
[0018]本专利技术筛选获得一株产海藻糖酶的野生菌，通过形态学和分子生物学鉴定将其命名为杓兰果胶杆菌Pectobacterium cypripedii，克隆了其海藻糖酶编码基因PCTre并在大肠杆菌体系实现了成功异源表达，酶活为289.40U/mL，蛋白分子量为64kDa。5L罐上发酵，28h时酶活可达到2150U/mL。对其酶学性质探究表明其能够在酸性条件下发挥水解作用，其反应的最适pH为5.5，最适温度为35℃。该酶具有良好的稳定性，能够耐受有机溶剂，尤其是乙醇体系下酶活性能够维持较长的时间。该酶对海藻糖有高度的水解特异性。此外，探究了以PCTre作为海藻糖酶，水解酵母制品最适宜的条件，即反应温度36℃、反应体系pH 5.5、酵母制品浓度5％，加酶量100U，水解时间20min。以海藻糖含量最高的Procelys Yeast Extract7样品为例(海藻糖含量为8.42％)，在最适反应条件下，其海藻糖在20min内可完成完全降解，体系中葡萄糖含量相应从1.45％增加到10.31％。后续研究将进一步优化重组菌的罐上发酵工艺，提高重组菌的酶活、降低生产成本，以期推进海藻糖酶在酵母制品水解及其他领域的工业化应用。
[0019]生物材料保藏：
[0020]杓兰果胶杆菌Pectobacterium cypripedii，于2019年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17442。
附图说明：
[0021]图1电镜下杓兰果胶杆菌Pectobacterium cypripedii的菌株形态。
[0022]图2基于杓兰果胶杆菌Pectobacterium cypripedii16S rDNA序列的系统进化树分析结果。
[0023]图3为PCR扩增海藻糖酶编码基因的核酸电泳图谱。泳道1
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5：扩增得到的海藻糖酶基因(PCTre)；泳道M：2000bp DNA Marker。
[0024]图4为pET
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3b(+)
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PCTre质粒双酶切后的核酸电泳图谱。泳道1
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5：双酶切后的 pET
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3b(+)
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PCTre质粒；泳道M：10000bp DNA Marker。
[0025]图5为重组菌E.coli BL21/pET
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3b(+)
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PCTre的SDS
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PAGE图谱。泳道1
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3：对照菌株破碎上清、E.coli BL21(DE3)/pET3b
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PCTre上清、E.coli BL21(DE3)/pET3b
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PCTre破碎上
BL21(DE3)中，发酵36h。离心收集菌体，将菌体用去离子水复溶，超声破碎30min，离心收集上清液和沉淀，分别进行酶活测定和SDS
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PAGE。
[0042]结果显示，海藻糖酶PCTre基因长度1656bp(SEQ No.2)，编码氨基酸55本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株杓兰果胶杆菌，命名为杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii)，其特征在于，于2019年03月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17442。2.一种海藻糖酶，其特征在于，所述海藻糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.一种编码权利要求2所述的海藻糖酶的基因。4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.一种携带权利要求3或4任一项所述的基因的表...

【专利技术属性】
技术研发人员：史劲松，龚劲松，高涵，许正宏，苏畅，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：