一种新型的抗体肽图检测还原方法技术

本发明专利技术涉及一种新型的抗体肽图检测还原方法，使用了半胱氨酸对抗体蛋白进行还原。本发明专利技术的检测方法适用于抗体的肽图分析，同时可以降低抗体肽图分析过程中的对环境的污染和对人体的危害。对人体的危害。对人体的危害。

【技术实现步骤摘要】
一种新型的抗体肽图检测还原方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种新型的抗体肽图检测还原方法，尤其涉及样品制备过程中新型还原剂的应用。

技术介绍

[0002]肽图分析(Peptide Mapping)是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片段，随后通过一定的分离检测手段(常用高效液相色谱)形成特征性指纹图谱。随着生物制药领域的不断发展，肽图分析已经成为是生物治疗药物表征过程中的关键步骤，可以实现生物药物的所谓“自下而上”的表征，从而确保生物药物分子的完整序列覆盖。
[0003]2020中华人民共和国药典&lt;3405&gt;肽图检查法中提到，当供试品为复杂的大分子时，必要时需进行二硫键还原等操作，以消除其高级结构对裂解剂的阻碍作用。目前，在对含有二硫键的蛋白进行肽图分析时，一般使用浓度约为20mM的二硫苏糖醇(DTT)将二硫键彻底还原。但是由于终浓度约为20mM的二硫苏糖醇(DTT)是由1M的DTT稀释而来，考虑到1M的DTT具有较强的刺激性气味，具有较高的生物毒性和环境污染风险等等，实验人员在实验过程中被提醒穿实验服，佩戴防毒面具并在通风橱操作，并且妥善丢弃实验垃圾，但是关于DDT及其他还原剂的危害仍旧不容忽视。我们认为需要将这一样品还原过程进行进一步优化，开发出具有等同还原效果的新方法，同时降低对环境的污染和对实验人员实验安全的影响，以便肽图分析能够更加安全地进行以适应当前蛋白类生物药分析业内的需求。<br/>
技术实现思路

[0004]本专利技术实际所要解决的技术问题，就是针对现有的抗体肽图分析方法的危害性较大的情况，提供了一种新型的抗体肽图检测还原方法，通过使用新型还原剂能降低样品制备过程对实验人员和环境的危害性，同时确保抗体的肽图分析结果的准确性。
[0005]本专利技术公开了一种新型的抗体肽图检测还原方法，使用了新型的还原剂对抗体蛋白进行还原，所述还原剂选自单硫醇化合物半胱氨酸；所述的抗体选自重组鼠源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化单克隆抗体、全人源单克隆抗体、抗体偶联药物、抗体融合蛋白、抗体片段和双特异抗体。
[0006]作为本专利技术的优选方案，所述方法包括如下步骤：
[0007]1)配制含有半胱氨酸的抗体肽图检测变性缓冲液；
[0008]2)用所配制的变性缓冲液孵育抗体样品；
[0009]3)样品经变性缓冲液孵育后加入半胱氨酸水溶液淬灭烷基化反应；
[0010]4)将经变性缓冲液孵育后的抗体样品置换成酶切缓冲液，对单抗样品进行酶切消化并进行高效液相色谱分析。
[0011]作为本专利技术的优选方案，所述变性缓冲液中游离巯基的浓度大于1mM，优选10
‑
80mM，更优选20
‑
40mM。
1M的DTT溶液，短暂涡旋后，在37℃下水浴1h，取出样品放室温。加入50μL 1M的IAM溶液，短暂涡旋至混合均匀。在室温下避光孵育15min，取出样品加入10μL 1M的DTT淬灭烷基化反应。随后置换成酶切缓冲液(25mM Tris，2mM CaCl2，pH 8.2)，取800μL置换后溶液加100μL 0.125mg/mL的胰蛋白酶溶液，对单抗蛋白进行酶切消化并进行高效液相色谱分析，结果如图2所示。
[0034]实施例2不同浓度半胱氨酸作用下重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体的肽图分析结果
[0035]配制含有不同浓度半胱氨酸的变性缓冲液(6M盐酸胍，360mM Tris，2mM EDTA，pH 8.6
±
0.1)，其中半胱氨酸的浓度分别为1mM、5mM、10mM、20mM、40mM和80mM。用上述含有不同浓度半胱氨酸的变性缓冲液将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(10mg/mL)稀释至浓度为1mg/mL，空白溶液做同比例稀释。短暂涡旋后，在37℃下水浴1h，取出样品放室温。分别向各组中加入相当于半胱氨酸1.25倍摩尔量的IAM(采用1M的IAM溶液加注)，短暂涡旋至混合均匀。在室温下避光孵育15min，取出样品加入IAM 0.2倍摩尔量的半胱氨酸淬灭烷基化反应。随后置换成酶切缓冲液(25mM Tris，2mM CaCl2，pH 8.2)，取800μL置换后溶液加100μL 0.125mg/mL的胰蛋白酶溶液，对单抗蛋白进行酶切消化并进行高效液相色谱分析，结果如图3所示。
[0036]结果表明，不同浓度的半胱氨酸作用下的液相谱图与DTT作为还原剂时几乎一样，表明半胱氨酸的还原效果较好，可以替代DTT实现肽图检测。其中，半胱氨酸的浓度优选20
‑
80mM，更优选20
‑
40mM。
[0037]实施例3含40mM半胱氨酸的不同pH的缓冲液作用下重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体的肽图分析结果
[0038]配制含有40mM半胱氨酸、6M盐酸胍以及2mM EDTA的不同pH的变性缓冲液，其中缓冲对选自Tris
‑
HCl和磷酸盐，pH值范围在6.0
‑
7.0之间的缓冲液选择磷酸盐缓冲对，pH值范围在7.5
‑
11.0之间的缓冲液选择Tris
‑
HCl缓冲对，从而配制得到以下不同pH的缓冲液：6.0、7.0、7.5、8.6、10.0和11.0等。
[0039]用上述含有40mM半胱氨酸的不同pH的变性缓冲液将重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体(10mg/mL)稀释至浓度为1mg/mL，空白溶液做同比例稀释。短暂涡旋后，在37℃下水浴1h，取出样品放室温。加入与半胱氨酸相应比例的50μL 1M的IAM溶液，短暂涡旋至混合均匀。在室温下避光孵育15min，取出样品加入125μL 80mM半胱氨酸淬灭烷基化反应。随后置换成酶切缓冲液(25mM Tris，2mM CaCl2，pH 8.2)，取800μL置换后溶液加100μL 0.125mg/mL的胰蛋白酶溶液，对单抗蛋白进行酶切消化并进行高效液相色谱分析，结果如图4所示。
[0040]结果表明，含有40mM半胱氨酸的不同pH的变性缓冲液作用下的液相谱图与DTT作为还原剂时几乎一样，表明半胱氨酸的还原效果在上述不同pH的缓冲液中一致性较好，其中，优选pH值范围在7.5
‑
11.0之间的Tris
‑
HCl缓冲液，更优选pH值为8.6
±
0.1的Tris
‑
HCl缓冲液。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型的抗体肽图检测还原方法，其特征在于，抗体样品的还原过程中使用新型的还原剂；所述的还原剂选自半胱氨酸；所述的抗体选自重组鼠源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化单克隆抗体、全人源单克隆抗体、抗体偶联药物、抗体融合蛋白、抗体片段或双特异抗体。2.根据权利要求1所述的肽图检测还原方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：1)配制含有半胱氨酸的抗体肽图检测变性缓冲液；2)用所配制的变性缓冲液孵育抗体样品；3)样品经变性缓冲液孵育后加入半胱氨酸水溶液淬灭烷基化反应；4)将经变性缓冲液孵育后的抗体样品置换成酶切缓冲液，对单抗样品进行酶切消化并进行高效液相色谱分析。3.根据权利要求2所述的肽图检测还原方法，其特征在于，所述变性缓冲液中游离巯基的浓度大于1mM，优选10
‑
80mM，更优选20
‑
40mM。4.根据权利要求2所述的肽图检测还原方法，其特征在于，所述变性缓冲液的变性剂选自盐酸胍，缓冲液选自Tris
‑
HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，其中，pH值范围在6.0
‑
7.0之间的缓冲液选择磷酸盐缓冲液；pH值范围在7.5
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：方伟杰，王思韬，沈斌彬，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：