载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向复合支架及应用制造技术

本发明专利技术提供了载有MSCs的PCL

【技术实现步骤摘要】
载有MSCs的PCL
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胶原蛋白/Gelma双径向复合支架及应用


[0001]本专利技术涉及鼓膜修复生物材料
，具体涉及载有MSCs的PCL
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胶原蛋白 /Gelma双径向复合支架及应用。

技术介绍

[0002]鼓膜(tympanic membrane，TM)是一种半透明的菲薄结构，由角质化的鳞状 上皮外层、纤维状中层和粘膜内层三层结构组成。造成鼓膜穿孔的最常见病因有 外伤、中耳炎和鼓膜置管术遗留的造口等。虽然大多数急性鼓膜穿孔是可以自愈 的，但面积较大的穿孔或慢性穿孔需要外科手术干预才能修复。穿孔的鼓膜如果 不能及时愈合，失去了阻挡外界细菌进入中耳的有效屏障，中耳感染的几率将大 大增加，严重者还有引起耳溢液、传导性听力下降甚至形成胆脂瘤等，造成严重 的并发症。鼓膜穿孔的自愈通过上皮细胞的移行而完成，但常缺少纤维中间层， 相较于正常鼓膜，自愈后的鼓膜更加脆弱、传声性能不理想、较易形成内陷袋， 并且在一定的气压伤时有再次穿孔的可能。修复穿孔鼓膜主要存在三个问题：(1) 缺乏支架结构；(2)新生血管生成能力弱和生长因子分泌不足；(3)细胞外基质 的缺乏导致细胞对新膜黏附力弱。
[0003]目前，治疗鼓膜穿孔的方式主要是鼓膜成形术和鼓室成形术，手术治疗中虽 有多种修补材料可供医生选择，如耳软骨、颞肌筋膜、耳小叶脂肪、耳屏软骨等 字体材料和透明质酸、胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖等人工材料，但这些材料往 往只提供机械支撑作用，缺乏促血管生成或细胞增殖作用，因此术后新生鼓膜无 法复制天然鼓膜的纤维解剖学和振动声学特性，所以重建类似原声鼓膜的三层结 构是十分必要的。
[0004]随着组织工程学和再生医学的发展，间充质干细胞(mesenchymal stem cells， MSCs)这一新型辅助材料的应用，在鼓膜穿孔治疗中显示出了巨大潜能。但目前 关于MSCs用于治疗鼓膜再生的研究较少，对于MSCs在治疗鼓膜穿孔方面的有 效性有待完善和评价。因此，本专利技术旨在提供载有MSCs的PCL
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胶原蛋白/Gelma 双径向复合支架用于鼓膜穿孔治疗并评价其有效性。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了载有MSCs的PCL
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胶原蛋白/Gelma双径 向复合支架及其应用，所述支架作为修复材料用于治疗鼓膜穿孔的治疗，所述支 架能够有效促进穿孔鼓膜的愈合，为治疗鼓膜穿孔提供了一种新的修复材料。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：
[0009]一方面，本专利技术提供了载有MSCs的PCL
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胶原蛋白/Gelma双径向复合支架， 所述支架主要由鱼胶原蛋白、聚己内酯(PCL)、间充质干细胞(MSCs)、甲基丙 烯酸明胶(Gelma)组成；所述支架按照以下步骤制备得到：
[0010](1)制备纺丝液：将鱼胶原蛋白在乙酸中溶解，制成混有质量分数为2wt％ 胶原蛋白的乙酸溶液；将PCL溶解于六氟异丙醇/含有胶原蛋白的乙酸溶液 (v/v＝9/1)，最终制备得到含有质量百分比为8％的PCL纺丝液；
[0011](2)制备仿生PCL支架：将步骤(1)得到的PCL纺丝液通过静电纺丝法获 得仿生的PCL支架；静电纺丝时，使用自定义的收集器，针与收集器之间的电压 为18kV，流速为0.3mL/h，针与收集器之间的距离为10cm，采用27号针用于挤 压，PCL沉积在自定义的收集器上，随后得到仿生的PCL支架，将打印出的支架 在酒精中消毒24小时，之后用PBS溶液清洗三遍，再用含有胚牛血清的高糖培养 基清洗一遍，随后干燥并剪成椭圆形的仿生PCL支架备用；
[0012](3)制备含有MSCs的Gelma溶液：使用离心机将第七代的MSCs离心，离 心条件为1000转/min，5min；将离心出来的MSCs加入到预热37℃的Gelma溶液 中，制备出含有MSCs的Gelma细胞悬液；
[0013](4)制备载有MSCs的PCL
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胶原蛋白/Gelma双径向结构复合支架：将步骤 (3)得到的细胞悬液转入带有细针头的注射器中，以步骤(2)得到的仿生PCL 支架的中心为起点，椭圆形的边界为终点，将细胞悬液以径向的方式注射到支架 上，之后用405nm的光源照射10s将细胞悬液固化在支架上，最终得到载有MSCs 的PCL
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胶原蛋白/Gelma双径向结构复合支架。
[0014]另一方面，本专利技术还提供了MSCs的PCL
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胶原蛋白/Gelma双径向复合支架的 应用，所述支架用于制备治疗鼓膜穿孔的修复材料。
[0015](三)有益效果
[0016]本专利技术提供了一种载有MSCs的PCL
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胶原蛋白/Gelma双径向结构复合支架 (简称为D
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PCOLG支架)，所述支架具有径向的纤维结构符合生理鼓膜的解剖特 点，能够更好的引导细胞的迁移和增殖，促进慢性鼓膜穿孔的愈合；所述支架具 有较大的孔隙率，能够为细胞的附着、生长和增殖提供较大的表面积，且支架中 含有的胶原蛋白和Gelma为细胞的生存提供很好地环境，有效维持细胞活力；所 述支架具有与鼓膜相似的厚度和相似的机械性能，在治疗鼓膜穿孔大鼠4周后可 有效将穿孔尺寸减少50.41％左右，治疗效果明显优于其他支架。D
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PCOLG支架在 大鼠TM穿孔模型的TM再生中具有显著优势，提供了一种新的用于制备治疗鼓 膜穿孔的修复材料。
附图说明
[0017]图1为自定义收集器结构示意图，具体的为由图钉的针尖充当电极，螺丝帽 的圆形边缘充当环形电极，将图钉套入到螺丝帽中制成自定义收集器。
[0018]图2为a支架(图2A)、b支架(图2B)、c支架(图2C)、d支架(图2D)、 e支架(图2E)的SEM图像。
[0019]图3分别a、b、c、d、e的五种支架经过活死细胞染色后的荧光显微镜拍摄图 像，其中活细胞呈绿色，死细胞呈红色。
[0020]图4为e支架HE染色图。
具体实施方式
[0021]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实 施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实 施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本 领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属 于本专利技术保护的范围。
[0022]实施例1
[0023]载有MSCs的PCL
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胶原蛋白/Gelma双径向复合支架，照以下步骤制备得到：
[0024](1)制备纺丝液：将鱼胶原蛋白在乙酸中溶解，制成混有质量分数为2wt％ 胶原蛋白的乙酸溶液；将PCL溶解于六氟异丙醇/含有胶原蛋白的乙酸溶液(v/v＝9/1)，最终制备得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.载有MSCs的PCL
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胶原蛋白/Gelma双径向复合支架，其特征在于，所述支架包括鱼胶原蛋白、聚己内酯(PCL)、间充质干细胞(MSCs)、甲基丙烯酸明胶(Gelma)。2.根据权利要求1所述的载有MSCs的PCL
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胶原蛋白/Gelma双径向复合支架，其特征在于，所述支架按照以下步骤制备得到：(1)制备纺丝液：将鱼胶原蛋白在乙酸中溶解，制成混有质量分数为2wt％胶原蛋白的乙酸溶液；将PCL溶解于六氟异丙醇/含有胶原蛋白的乙酸溶液(v/v＝9/1)，最终制备得到含有质量百分比为8％的PCL纺丝液；(2)制备仿生PCL支架：将步骤(1)得到的PCL纺丝液通过静电纺丝法获得仿生的PCL支架；静电纺丝时，使用自定义的收集器，针与收集器之间的电压为18kV，流速为0.3mL/h，针与收集器之间的距离为10cm，采用27号针用于挤压，PCL沉积在自定义的收集器上，随后得到仿生的PCL支架，将打印出的支架在酒精中消毒24小时，之后用PBS溶液清洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：李谊，胡浩磊，李硕，
申请(专利权)人：中国人民解放军联勤保障部队第九八八医院，
类型：发明
国别省市：