一种成纤维细胞植入物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种成纤维细胞植入物及其制备方法和应用，该细胞植入物是由表达耐酶解胶原蛋白的自体成纤维细胞所组成，耐酶解是指具有裂解胶原蛋白三股螺旋结构的蛋白酶；此细胞植入物可以直接用于修补皮肤和软组织缺损，如皱纹填补，皮肤扩张纹，凹陷性瘢痕修复，非创伤性皮肤凹陷修复、嘴唇增厚、牙龈组织修复、阴道组织修复等皮肤和软组织修复用途。道组织修复等皮肤和软组织修复用途。道组织修复等皮肤和软组织修复用途。

【技术实现步骤摘要】
一种成纤维细胞植入物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于细胞治疗
，具体涉及一种表达耐酶解胶原蛋白的自体成纤维细胞及其应用。

技术介绍

[0002]成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织(lose connective tissue)中的主要细胞成分，负责表现并分泌多种细胞外基质(extracellular matrix，简称ECM)，包含结构性蛋白如纤维胶原蛋白(fibrous collagen)和弹力蛋白(elastin)、粘性蛋白如层粘蛋白(laminin)和 (fibronectin)及基底物质如透明质酸(hyaluronan)等粘粘多糖(glycosaminoglycans)；成纤维细胞在许多生理与病理功能上扮演重要角色,如维持ECM代谢的稳定、伤口愈合(woundhealing)、发炎反应(inflammation)或组织纤维化(tissue fibrosis)等。
[0003]自体成纤维细胞疗法(autologous fibroblast therapy)是一种现行的细胞治疗方式，常用于协助困难伤口愈合、促进烧烫伤愈合、软组织缺损填补、皱纹填补等用途。自体成纤维细胞疗法需要三大步骤：1、自患者身体提取一小块健康组织；2、进行组织中成纤维细胞的纯化与扩增培养；3、将一定量成纤维细胞悬浮液注射或喷涂等方式应用至患部；自体成纤维细胞疗法主要目的之一是透过植入的自体成纤维细胞产生胶原蛋白，以对缺损组织产生支撑与填补作用，或协助伤口愈合。
[0004]胶原蛋白(collagen)是由28种蛋白所构成的家族，其分子特征是由三股具有α螺旋结构的肽链所组成，胶原蛋白的分型以希腊数字做区分，同一型胶原蛋白的不同肽链则以阿拉伯数字作区别，例如第Ⅰ型胶原蛋白的二种肽链为α1(Ⅰ)和α2(Ⅰ)；胶原蛋白的α链具有独特的 (GXY)三个胺基酸重复片段的区域，其中，G为甘氨酸、X多为脯氨酸或其他胺基酸、Y多为羟脯氨酸或其他胺基酸，三条肽链透过(GXY)重复片段缠绕成为特殊的绳索状三股螺旋结构。
[0005]胶原蛋白的绳索状三股螺旋结构使其能抵抗多数蛋白酶(proteinases)的分解，当胶原蛋白失去完整三螺旋结构时，即可被许多蛋白酶分解成小分子胶原肽或胺基酸。人体中目前已知具有裂解胶原蛋白完整三螺旋结构的酵素以基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，简称MMPs)为主，MMPs透过辨识并结合到胶原蛋白的特定部位以进行分解，MMP酶切位点(cleavage site)二侧氨基酸序列是决定MMPs能否辨识的重要关键，酶切位点氨基端序列由近而远依序为P1、P2、P3、P4....，酶切位点羧基端序列由近而远依序为P1'、P2'、P3'、P4'....，若改变P2、P1
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、P2
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、P7
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、P8
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、P10
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的一个或多个位点后，可降低MMPs对胶原蛋白分子的结合与裂解，进而增加胶原蛋白在体内的安定性与存在量。
[0006]皮肤或多数软组织中的成纤维细胞以表达和分泌第Ⅰ型和第Ⅲ型胶原蛋白为主，若能使这些成纤维细胞表达耐酶解的第Ⅰ型或第Ⅲ型胶原蛋白，可以增加植入细胞所表达和分泌出的胶原蛋白安定性及填补部位的胶原蛋白沉积量(collagen deposit)，并在较低的成纤维细胞数量需求条件下，产生充足的胶原蛋白及填补效果。这将有助于减少培养所
需时间，降低成纤维细胞培养生产成本，使自体成纤维细胞疗法更能广泛被使用。
[0007]专利技术人在实际使用过程中发现，现有自体成纤维细胞医疗制品至少存在以下问题：植入到组织后的效能维持时间短、需要频繁使用以维持产品效能等问题，因而造成自体成纤维细胞医药制品使用成本高，限制了自体成纤维细胞医药制品的普及化使用。

技术实现思路

[0008]进一步的优选技术方案为：一种自体成纤维细胞植入物，其特征在于：该植入物是由表达耐酶解胶原蛋白的自体成纤维细胞所组成；
[0009]进一步的优选技术方案为：所述表达耐酶解胶原蛋白的自体成纤维细胞对具有裂解胶原蛋白三股螺旋结构的蛋白酶具有抗性，所述蛋白酶包括人类基质金属蛋白酶1、2、8、12、13、14、18。
[0010]进一步的优选技术方案为：所述表达耐酶解胶原蛋白的自体成纤维细胞中的胶原蛋白包括Ⅰ型胶原蛋白α1链、Ⅰ型胶原蛋白α2链、Ⅲ型胶原蛋白α1链中的一种或多种。
[0011]进一步的优选技术方案为：所述耐酶解型人源胶原蛋白是将重组人源胶原蛋白α链中的MMP酶辨识部位进行点突变(pointmutation)，主要突变位点包含MMP酶辨识部位中P2、P1
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、P2
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、P7
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、P8
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、P10
’
的一个或多个，相对应氨基酸序列见图二灰底标示处，突变后氨基酸位点以粗体标示；点突变后可将野生型胶原蛋白(wild
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type,简称WT)改变为耐酶解型胶原蛋白(degradation
‑
resistanttype,简称DR)，使其对MMP产生抗性；上述胶原蛋白链均由野生型(wild
‑
type,WT)改变为耐酶解型(degradation
‑
resistanttype,DR)，相对应氨基酸序列见图1：
[0012]进一步的优选技术方案为：α1(Ⅰ)链主要突变位点包含MMP酶辨识部位中P2、P1
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、P2
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、P7
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、P8
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、P10
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的一个或多个；α2(Ⅰ)链主要突变位点包含MMP酶辨识部位中P2、P1
’
、P7
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、P8
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、P10
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的一个或多个；α1(Ⅲ)链主要突变位点包含MMP酶辨识部位中P1
’
、P2
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、P10
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的一个或多个；
[0013]进一步的优选技术方案为：所述表达胶原蛋白，表达方法包含但不限于基因转殖或/和基因敲入；基因转殖(transgenicgene)策略：先透过使用野生型(wild
‑
type)胶原蛋白互补脱氧核糖核酸(complementaryDNA,简称cDNA)模板、点突变引物(site
‑
directed
[0014]mutagenesisprimer)及聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)方法来达成点突变，扩增出耐酶解胶原蛋白互补脱氧核糖核酸，再将耐酶解胶原蛋白互补脱氧核糖核酸克隆至适当表现载体(expressionvectors)后，以携带耐酶解型胶原蛋白基因的一般表现载体(expressionvector)、腺病毒载体(adenoviralvector)、反转录病毒载体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种成纤维细胞植入物，其特征在于：该植入物是由表达耐酶解胶原蛋白的自体成纤维细胞所组成。2.根据权利要求1所述的一种成纤维细胞植入物，其特征在于，所述表达耐酶解胶原蛋白的自体成纤维细胞对具有裂解胶原蛋白三股螺旋结构的蛋白酶具有抗性，所述蛋白酶包括人类基质金属蛋白酶1、2、8、12、13、14、18。3.根据权利要求1所述的一种成纤维细胞植入物，其特征在于，所述表达耐酶解胶原蛋白的自体成纤维细胞中的胶原蛋白包括Ⅰ型胶原蛋白α1链、Ⅰ型胶原蛋白α2链、Ⅲ型胶原蛋白α1链中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的一种成纤维细胞植入物，其特征在于，所述表达耐酶解胶原蛋白的自体成纤维细胞的表达方法包括基因转殖或基因敲入。5.根据权利要求1所述的一种成纤维细胞植入物，其特征在于，所述自体成纤维细胞包括提取自皮肤、牙龈、阴道或其它自体软组织、由自体间充质干细胞分化而来、或由自体诱导多能干细胞分化而来。6.一种表达耐酶解胶原蛋白的自体成纤维细胞的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：S1：获取自体成纤维细胞，包括提取自皮肤、牙龈、阴道或其它自体软组织、由自体间充质干细胞分化而来、或由自体诱导多能干细胞分化而来；S2：通过基因转殖或基因敲入使所述自体成纤维细胞中重...

【专利技术属性】
技术研发人员：周江鸿，李同琪，徐震梅，洪涛，李朔，
申请(专利权)人：尚诚怡美成都生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：