一种迟缓爱德华菌实时荧光PCR检测方法及应用技术

本发明专利技术涉及基于MGB探针的实时荧光PCR反应快速检测体系对4种迟缓爱德华菌血清型菌株进行检测。本发明专利技术以4种血清型迟缓爱德华菌的wzx基因为靶基因，设计和筛选了针对每一个血清型的Taqman特异性引物及MGB探针，并建立了实时荧光PCR检测方法。利用本发明专利技术提供的方法可以准确、快速、灵敏地对4种迟缓爱德华菌血清型菌株进行分子生物学检测。型菌株进行分子生物学检测。

【技术实现步骤摘要】
一种迟缓爱德华菌实时荧光PCR检测方法及应用


[0001]本专利技术属于细菌检测方法
，涉及用于迟缓爱德华菌4种血清型的实时荧光PCR检测方法及应用。

技术介绍

[0002]迟缓爱德华菌可在大多数水环境中生存，是一种人畜共患病菌，可对多种经济型鱼类造成感染，造成严重的经济损失。同时，该菌也可以感染哺乳动物及人类，其中最常见的感染疾病是胃肠炎，若不慎引发肠外或全身感染，还可导致较高的死亡率。
[0003]细菌的血清型与致病性密切相关，同一种内不同血清型细菌的致病性往往存在着很大差异。血清学分型自上世纪30年代开始被广泛使用，至今已有超过80年的历史，可在种/属内将细菌进一步分类，是一种重要的细菌鉴定方法，目前，血清学鉴定方法是应用最为普遍的致病菌鉴定和溯源方法。传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长；血清的生产和质控较为困难；同一血清型菌株与不同抗血清容易发生交叉反应等。
[0004]细菌表面多糖抗原主要包括O多糖（O抗原）、普通抗原（CA）、胞外多糖抗原、芽孢、以及荚膜多糖（K抗原）等。基于上述表面多糖抗原的多样性，细菌可被分为不同的血清型。同一细菌不同血清型的O抗原多样性，是由于编码合成O抗原的各种酶的基因的遗传多样性决定的，这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点，被称作O抗原基因簇。其中，编码O抗原翻转酶的wzx基因和聚合酶的wzy基因，通常具备血清型特异性，被用作利用分子生物学手段开发致病菌血清型鉴定技术的检测靶标。
[0005]TaqMan实时荧光PCR（Real
‑
time fluorescence PCR）技术原理是，将标记有荧光素的TaqMan探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的TaqMan探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光。随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得循环阈值（Ct值），即可表征检测样品的类型和含量。
[0006]TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其 5' 末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等， 3' 端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq 酶的5'
‑
3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
[0007]TaqMan
‑
MGB 探针是近年来在 TaqMan探针的基础上改进的一种新技术，它在探针 3
′ꢀ
端增加了MGB分子，这种物质能够提高探针的退火温度( Tm值) ，从而使它能够分辨 1个碱基的差别，完全配对，有荧光信号；只要有一个碱基不匹配，就没有信号。探针的设计首先为15
‑
30 nt长度，Tm为68
‑
70 ℃。 探针由AuGCT Biotechnology Corporation（中国北
京）合成，分别在 5' 和 3' 末端具有6
‑
羧基荧光素（FAM）和小沟结合（MGB）部分。引物的长度约为25 nt ，Tm在55
‑
60 ℃之间。 产生的PCR产物在50
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200 bp之间。 引物由Invitrogen（中国上海）合成。 如果正向引物的3'末端距离探针的5' 末端1
‑
20 nt（通常为10 nt或更少），则可能更好。
[0008]利用Taqman MGB PCR检测时，扩增反应在25 μL的总体积中进行，包括12.5 μL Premix Ex Taq
TM
（Takara），0.3 μL各10 μM正向和反向引物，0.3 μL 10 μM探针，0.2 μL ROXII，0.2 μL 待检测样品的核酸DNA和11.2 μL ddH2O。 一个方案包括在95 ℃下进行2分钟的初始变性步骤，然后在95 ℃下变性30秒，在60 ℃下退火30秒进行40个循环，利用实时荧光PCR 系统进行检测和结果分析。Ct值<26 且出现扩增曲线，则判断样品为阳性，否则为阴性。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于提供一种可对迟缓爱德华菌4种血清型进行鉴定的实时荧光PCR检测技术，为这种致病菌的快速检测提供有效的技术手段。
[0010]为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：一种对不同迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物，其特征是在迟缓爱德华菌4种血清型菌株G6053、G6057、G6058、G6059的wzx基因中分别选取的2个DNA片段，其序列如SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:8所示。
[0011]本专利技术同时也公开了对不同血清型迟缓爱德华菌分别特异的MGB探针，其特征是2个Taqman引物的内部，且含有5'报告染料（FAM）和3'非荧光猝灭剂（NFQ），在3'末端与小沟结合物（MGB）缀合，其序列如SEQ ID NO:9
‑
SEQ ID NO:12所示。
[0012]本专利技术所述的不同迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物和MGB探针，上述体系的组成成分和浓度如下：
本专利技术更进一步公开了对不同血清型迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物和MGB探针在用于检测迟缓爱德华菌方面的应用。实验结果显示，可以实现对迟缓爱德华菌4种血清型的准确检测，对于基因组DNA的检测灵敏度可达1ng，且自获得基因组DNA或纯培养菌落计，可在3个小时内完成检测。
[0013]本专利技术更加详细的描述如下：本专利技术涉及一种对不同的迟缓爱德华菌4种血清型分别特异的Taqman引物序列，MGB探针序列及实时荧光PCR检测方法。其中：所述的Taqman引物是在迟缓爱德华菌G6053、G6057、G6058、G6059的wzx基因中分别选取的2个DNA片段，其序列如SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:8所示。
[0014]SEQ ID (5'
‑
3')
NO:1 TTGATGCCTTCTCCTTTCGATT扩增迟缓爱德华菌G6053 wzx基因的上游引物P1NO:2 AGGAGAGGCACCCCAAAAA扩增迟缓爱德华菌G6053 wzx基因的下游引物P2NO:3 TGTCTCTGCGGCCGTTATTA扩增迟缓爱德华菌G6057 wzx基因的上游引物P3NO:4 TGCCATAACCCCACCGATA扩增迟缓爱德华菌G6057wzx基因的下游引物P4NO:5 TGTTTTTTATGGAGGTAAGGTTAAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对不同迟缓爱德华菌分别特异的Taqman引物，其特征是在4种血清型的迟缓爱德华菌G6053、G6057、G6058、G6059的wzx基因中分别选取的2个DNA片段，其引物序列依次如SEQ ID NO:1
‑
SEQ ID NO:8所示。2.一种对4种血清型的迟缓爱德华菌分别特异的MGB探针，其特征是位于权利要求1中2个Taqman引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭玺，刘斌，武潘，王婧，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：