用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合、试剂盒和检测方法，本发明专利技术提供的检测方法简化了多重PCR体系的优化过程，克服了传统的细菌耐药性的E

【技术实现步骤摘要】
用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合、试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，特别是涉及用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合、试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是慢性活动性胃炎的直接病因，与消化性溃疡、黏膜相关性淋巴样组织淋巴瘤密切相关，是胃癌发生的危险因子。根除幽门螺杆菌是临床治疗慢性胃病的重要策略，不仅能加速消化性溃疡的愈合，而且能显著降低溃疡复发率，也可以减少早期胃癌术后的复发。目前，克拉霉素是临床上根除幽门螺杆菌治疗最常选用的抗生素之一，但随着克拉霉素等抗生素的广泛应用，幽门螺杆菌的耐药率逐年上升。
[0003]传统的细菌耐药性的研究方法为E
‑
Test实验，但幽门螺旋杆菌是微需氧菌，分离和培养菌株的周期长，需要一周左右时间，并且培养难度大，成功率低，不能在第一时间给医师提供诊断和治疗依据。
[0004]目前已基本明确幽门螺杆菌对克拉霉素耐药的机制是由于耐克拉霉素幽门螺杆菌的23S rRNA基因的V区发生点突变，导致核糖体构象改变，同时大环内酯类抗生素结合位点也随之发生改变，进而使幽门螺杆菌与大环内酯类药物亲合力减弱，导致药物不能阻止细菌的蛋白合成，最终产生耐药。克拉霉素耐药幽门螺杆菌23S rRNA基因中A2142C、A2142G、A2143G的突变率分别为1.5％、6.2％和84.6％。因此，应用PCR技术检测幽门螺杆菌23S rRNA基因突变得到一定认可，幽门螺杆菌对克拉霉素耐药研究也常以此为基础。
[0005]公开专利技术“多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒”(公开号：CN111850154A)提供了对23rRNA基因中A2142C和A2142G位点的试剂盒，然而熔解曲线毕竟是数学推导，在结果中也包含了仪器的误差，对扩增仪器的要求也较高。并且同一反应体系中进行多目标特异性扩增会出现引物非特异性结合。专利“一种试剂盒、试剂盒的使用方法、试剂盒的用途)(公开号：CN107312832A)提供了23S rRNA基因A2142G/C突变检测特异性引物对，其应用ARMS
‑
PCR原理进行检测，条件摸索困难度高。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术检测对扩增仪器要求高、特异性差的问题，本专利技术提供一种侨联引物探针组合用于荧光定量PCR检测幽门螺旋杆菌点突变，还提供了一种试剂盒和检测方法，用于检测幽门螺杆菌23S rRNA基因的2142多态性位点的点突变A2142G，桥联引物由三个部分组成：5
’
端部分、3
’
端部分以及连接两端的多聚次黄嘌呤。
[0007]作为本专利技术的第一个目的，在于提供一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合，包括：
[0008]如SEQ ID No.1所示的上游引物HP
‑
A2142G
‑
DPOF的碱基序列GA之间插入I碱基，其碱基序列为：CTACCCGCGGCAAGACGGG(I)
n
AAGACCC；
[0009]如SEQ ID No.2所示的下游引物HP
‑
A2142G
‑
DPOR的碱基序列AG之间插入I碱基，其碱基序列为:TACTTCAA(I)
n
AGCCTCCCACCTAT；
[0010]如SEQ ID No.3所示探针HP
‑
A2142G
‑
DPOP，其碱基序列为:FAM
‑
ACCCCGTGGACCTTTACTACAACT
‑
BHQ1；
[0011]其中，I表示次黄嘌呤，n为次黄嘌呤的数量，选自数量为3
‑
8个，优选5或者6。
[0012]作为本专利技术的第二个目的，在于提供一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的试剂盒，包括所述的用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合。
[0013]优选的，所述试剂盒还包括反应液、酶混合液、阳性对照、阴性对照；所述反应液包括dNTPs、Mg
2+
、Tris
‑
HCl，所述酶混合液包括反转录酶、Taq DNA聚合酶。
[0014]采用本专利技术提供的试剂盒，可体外检测幽门螺旋杆菌感染患者胃粘膜组织样本或粪便样本中幽门螺杆菌23S rRNA基因点突变A2142G。
[0015]作为本专利技术的第三个目的，在于提供一种幽门螺杆菌23S rRNA基因点突变A2142G检测方法，包括以下步骤：
[0016]步骤(1)，提取待测样品中的核酸；
[0017]步骤(2)，以步骤(1)中提取的核酸为模板，进行荧光定量PCR扩增反应；
[0018]步骤(3)，根据FAM通道扩增曲线和CT值进行结果分析。
[0019]进一步的，步骤(2)中PCR反应体系以25μl计为：
[0020][0021]进一步的，步骤(2)中荧光定量PCR反应条件为：94℃5分钟；94℃15秒，60℃30秒，采集FAM通道荧光，共40个循环。
[0022]进一步的，步骤(3)中，检测结果的判断标准为：CT值≤38且具有S型扩增曲线，则为幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G点突变阳性，CT值＞38或无CT值则为幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G点突变阴性。
[0023]作为本专利技术的第四个目的，在于提供所述的桥联引物探针组合在检测幽门螺杆菌点突变中的应用，以及所述的试剂盒在检测幽门螺杆菌点突变中的应用。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0025]1、本专利技术提供了一种用于荧光定量PCR检测幽门螺旋杆菌点突变的检测方法，该检测方法简化了多重PCR体系的优化过程，克服了传统的细菌耐药性的E
‑
Test实验研究方法分离和培养菌株的周期长，培养难度大的缺陷，本专利技术提供的方法检测时间少于两个小时，大大提升了检测效率；
[0026]2、本专利技术提供的检测方法与普通多重PCR相比有较高的敏感性，灵敏度可测达到
500copies/ml；特异性强，降低了引物的非特异性扩增。
[0027]3、相对于熔解曲线法，本申请采用桥联引物技术，避免了熔解曲线的结果误差和多重PCR的引物非特异性结合，适合点突变序列的检测。
[0028]4、同时，本申请采用的桥联引物法相对于ARMS
‑
PCR原理，操作更加简单便捷，降低了引物的非特异性扩增，与之相比有较高的灵敏度。
附图说明
[0029]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0030]图1为引物不同浓度下扩增效果图。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合，其特征在于，包括：如SEQ ID No.1所示的上游引物HP
‑
A2142G
‑
DPOF的碱基序列GA之间插入I碱基，其碱基序列为：CTACCCGCGGCAAGACGGG(I)
n
AAGACCC；如SEQ ID No.2所示的下游引物HP
‑
A2142G
‑
DPOR的碱基序列AG之间插入I碱基，其碱基序列为:TACTTCAA(I)
n
AGCCTCCCACCTAT；如SEQ ID No.3所示探针HP
‑
A2142G
‑
DPOP；其中，I表示次黄嘌呤，n为次黄嘌呤的数量，选自数量为3
‑
8个。2.根据权利要求1所述的一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合，其特征在于，所述上游引物和下游引物中分别插入5个或6个I碱基。3.根据权利要求1或2任一项所述的一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合在检测幽门螺杆菌点突变中的应用。4.一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1所述的用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的桥联引物探针组合。5.根据权利要求4所述的一种用于荧光定量PCR检测幽门螺杆菌点突变的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈旭，
申请(专利权)人：山东安珀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：