转基因小麦外源插入片段的旁侧序列及检测方法技术

本发明专利技术涉及农业生物技术领域，特别的涉及一种转基因抗赤霉病小麦OExat

【技术实现步骤摘要】
转基因小麦外源插入片段的旁侧序列及检测方法


[0001]本专利技术涉及农业生物
，特别的涉及转基因小麦外源插入片段的旁侧序列及检测方法，更为具体的是涉及一种转基因抗赤霉病小麦OExat
‑
003外源插入片段NOS端的旁侧序列及其应用。

技术介绍

[0002]赤霉病(Fusarium Head Blight)是小麦的重要病害之一，影响小麦产量和品质，危害我国粮食安全。通过转基因技术可以赋予作物更高的抵御病原菌的能力，为病害防治提供了一种新的途径。CN201611148584 .2公开了小麦基因TaXAT基因具有增强植物赤霉病抗性的作用。转基因抗赤霉病小麦OExat
‑
003转化体为在小麦中过表达TaXAT基因的新型转基因事件，目前已经通过连续多代的分子鉴定和高代品系的转基因中间试验表明转化体中转基因成分稳定遗传，对赤霉病的抗性增强，农艺性状无不良变化（农业转基因生物安全管理办公室，农基安办报告字(2017)第747号）。
[0003]然而，外源基因片段在作物基因组上的整合具有随机性，需要通过大量的转化体筛选获得表达量高和抗病表型优良的转化事件。分离外源片段旁侧序列，设计转化事件的特异性引物可以有效地筛选靶标转化体，对转化事件进行特异性鉴定。此外，转化事件的特异性检测方法的建立为靶标转基因事件及其衍生产品的特异性检测提供了依据，可用于转基因成分的检测和转基因产品的监管。建立转基因事件特异性检测方法的基础是外源片段在作物基因组DNA序列上的整合位点旁侧序列的特异性和独立性。在同一转化试验中，不同的转化体的整合位置和位点旁侧序列是高度特异性的，不可重复的。因此，可以根据外源插入片段旁侧序列设计转基因事件的特异性的定性和定量的引物建立检测方法。外源片段插入位点旁侧序列的分离方法有：热不对称交错聚合酶链式反应、反向聚合酶链式反应、质粒拯救和基因组步移等。与其他旁侧序列分离的方法相比，热不对称交错聚合酶链式反应具有特异性高、扩增效率高、无需繁琐的酶切步骤等。

技术实现思路

[0004]目前未见转基因抗赤霉病小麦OExat
‑
003外源插入片段NOS（根癌农杆菌终止子）端的旁侧序列，以及基于此序列建立转基因事件的定性和定量检测方法的发表文献。为此，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种转基因抗赤霉病小麦OExat
‑
003外源插入片段NOS端的旁侧序列，本专利技术以转基因小麦OExat
‑
003基因组DNA为模板，采用热不对称交错聚合酶链式反应(Tail
‑
PCR)方法，经过2轮扩增反应，获得转基因小麦OExat
‑
003外源插入序列NOS端的旁侧序列，所述序列如SEQ ID NO.11所示，所述序列的第1至2191碱基为外源载体序列；第2192至2222碱基为填充序列；第2223至2635碱基为小麦基因组序列；第1至2635碱基共同组成转基因抗赤霉病小麦OExat
‑
003外源插入片段NOS端的旁侧序列。
[0005]本专利技术的一个方面，本专利技术提供了如SEQ ID NO.11所示的旁侧序列在小麦转基因
检测中的应用，通过在转基因小麦OExat
‑
003中定性或定量检测所述旁侧序列，可以判断小麦中是否含有特异性转基因转化事件。优选的，采用SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示的引物对旁侧序列进行定性检测；采用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物和SEQ ID NO.5所示探针对旁侧序列进行定量检测。
[0006]本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了转基因小麦OExat
‑
003的特异性转化事件的定性检测方法，其具体步骤为：利用小麦全基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示的引物对进行PCR扩增，扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳后获得检测结果，若扩增产物中同时含有大小为336bp的条带，则判定小麦样品中含有转基因小麦OExat
‑
003的特异性转基因转化事件；否则，判定为不含有转基因小麦OExat
‑
003的特异性转基因转化事件。PCR扩增体系：10
×
buffer 1
µ
l，浓度为25mM的MgCl
2 0.5
ꢀµ
l, 浓度为2.5mM的dNTP0.5
ꢀµ
l，浓度为10
µ
M的引物SEQ ID NO.1 0.5
ꢀµ
l，浓度为10
µ
M的引物SEQ ID NO.2 0.5
ꢀµ
l，浓度为5U/
µ
l的Taq聚合酶 0.2
ꢀµ
l，模板 DNA 10
‑
100 ng，ddH2O补足至10
ꢀµ
l； PCR扩增程序：94
˚
C 3分钟；94
˚
C10秒，57
˚
C 30秒，72
˚
C 20秒，30个循环；72
˚
C延伸5分钟。
[0007]本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了转基因小麦OExat
‑
003的特异性转基因转化事件的定量检测方法，其具体步骤为：使用基于Taqman探针的荧光定量PCR扩增方法建立检测方法，即利用小麦全基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物、SEQ ID NO.5所示探针，在全自动荧光定量PCR仪上进行扩增。若出现正常的荧光扩增曲线，且Ct值小于35，则判定小麦样品中含有转基因小麦OExat
‑
003的特异性转基因转化事件；否则，判定为不含有转基因小麦OExat
‑
003的特异性转基因转化事件。荧光定量PCR扩增体系：2
×
SGExcel GoldStar TaqMan Mixture 10
µ
l，浓度为10
µ
M的引物SEQ ID NO.3 0.4
ꢀµ
l，浓度为10
µ
M的引物SEQ ID NO.4 0.4
ꢀµ
l，浓度为10
µ
M的Taqman探针引物SEQ ID NO.5 0.4
ꢀµ
l，模板 DNA 0.1
‑
100 ng，ddH2O补足至20
ꢀµ
l； PCR扩增程序：95
˚
C 预变性10分钟；95
˚
C变性15秒，60
˚
C 退火/延伸1分钟，30个循环。
[0008]本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了一种转基因抗赤霉病小麦OExat
‑
003外源插入片段NOS端的旁侧序列的试剂或试剂盒，所述试剂包括SEQ ID NO.1，SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转基因抗赤霉病小麦OExat
‑
003外源插入片段NOS端的旁侧序列，其特征在于：所述旁侧序列如SEQ ID NO.11所示，所述序列的第1至2191碱基为外源载体序列；第2192至2222碱基为填充序列；第2223至2635碱基为小麦基因组序列；第1至2635碱基共同组成转基因抗赤霉病小麦OExat
‑
003外源插入片段NOS端的旁侧序列。2.根据权利要求1所述的旁侧序列在小麦转基因检测中的应用，其特征在于，在转基因小麦OExat
‑
003中定性或定量检测所述旁侧序列，以判断小麦中是否含有特异性转基因转化事件。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示的引物对旁侧序列进行定性检测；采用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的引物和SEQ ID NO.5所示探针对旁侧序列进行定量检测。4.一种转基因抗赤霉病小麦OExat
‑
003外源插入片段NOS端的旁侧序列的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S11、获得小麦样品中的小麦全基因组DNA；S12、以SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示的引物进行PCR扩增，获得扩增产物；S13、检测扩增产物，根据扩增产物判断小麦样品中是否存在特异性转基因转化事件。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤S12中PCR扩增的扩增体系为：10
×
buffer 1
µ
l，浓度为25mM的MgCl
2 0.5
ꢀµ
l, 浓度为2.5mM的dNTP0.5
ꢀµ
l，浓度为10
µ
M的引物SEQ ID NO.1 0.5
ꢀµ
l，浓度为10
µ
M的引物SEQ ID NO.2 0.5
ꢀµ
l，浓度为5U/
µ
l的Taq聚合酶 0.2
ꢀµ
l，模板 DNA 10
‑
100 ng，ddH2O补足至10
ꢀµ
l；PCR扩增程序为：94
˚
C 3分钟；94
˚
C10秒，57
˚
C 30秒，72
˚
C 20秒，30个循环；72
˚
C延伸5分钟。6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴磊，周克海，张旭，马雄风，何漪，闫东良，姜朋，杨蕊，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：