非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法技术

本发明专利技术涉及检测技术领域，具体涉及一种非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法。所述检测方法包括对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测的操作，所述待测样品由待检样本经蛋白降解处理后制得。该检测方法所使用的待测样品由待检样本经蛋白降解处理后制得，其中通过蛋白降解处理，能够降解蛋白结合态鹅膏毒肽中的蛋白，从而释放出更多的游离态鹅膏毒肽。因此，本发明专利技术所使用的待检样品中含有的游离态鹅膏毒肽，由原有游离态鹅膏毒肽以及蛋白结合态鹅膏毒肽释放出的游离态鹅膏毒肽组成，也即，本发明专利技术的检测方法能够同时检测待检样本中含有的游离态和蛋白结合态的鹅膏毒肽，这能够显著延长鹅膏毒肽的检测窗口期，有效提升鹅膏毒肽的检出率。率。率。

【技术实现步骤摘要】
非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法


[0001]本专利技术涉及检测
，具体涉及一种非诊断目的的鹅膏毒肽检测方法。

技术介绍

[0002]蘑菇中毒是引起食物中毒死亡的主要原因之一，也是影响公众健康的突出公共卫生问题之一。蘑菇中毒死亡事件调查数据显示，蘑菇中毒致死的主要原因是毒蘑菇中含有鹅膏毒肽，《中国含鹅膏毒肽蘑菇中毒临床诊断治疗专家共识》(2020年)中指出，90％的蘑菇中毒死亡事件是由蘑菇中含有的鹅膏毒肽引起中毒者急性肝衰竭所致。在已知的鹅膏毒肽中，α
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鹅膏毒肽的毒性最强，也是最具有代表性的鹅膏毒肽类毒素。因此，对α
‑
鹅膏毒肽的毒性和化学特性进行研究，对于蘑菇鹅膏毒肽中毒临床问题的解决有重要价值。
[0003]《中国含鹅膏毒肽蘑菇中毒临床诊断治疗专家共识》(2020年)中指出，中毒者生物样本(包括血液、尿液和胃液等)中检出鹅膏毒肽毒素，是蘑菇鹅膏毒肽中毒的重要诊断依据。《中国含鹅膏毒肽蘑菇中毒临床诊断治疗专家共识》(2020年)中进一步提示：液相色谱串联质谱法(LC
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MS)是常用的鹅膏毒肽检测方法，其中，血液、尿液的检测时间窗口分别为进食毒蘑菇后的48h以内和96h以内。
[0004]然而，蘑菇鹅膏毒肽中毒的中毒病程可分四个阶段：进食毒蘑菇后有12h的潜伏期，潜伏期结束后患者出现以呕吐和腹泻为特征的首发症状；随后，患者可能进入没有任何症状的假愈期；2天后，患者症状加重，进入医院治疗；之后，患者出现以肝损坏为主的全身症状，进入暴发性肝衰竭期，进入此阶段的严重者可在3
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7天死亡，患者病死率高达30
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60％。
[0005]也就是说，进食毒蘑菇后，中毒者入院治疗的时间大多在食入毒蘑菇48h后，此时患者血、尿中游离的鹅膏毒肽很可能已经排出体外，导致患者血、尿等生物样品中的鹅膏毒肽因含量低于检测限(LOD，0.5
‑
1μg/L)而无法被检出。因此，现有鹅膏毒肽检测方法的检测窗口期较短，鹅膏毒肽检出率较低，无法准确检测患者生物样品中的鹅膏毒肽。

技术实现思路

[0006]因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有鹅膏毒肽检测方法中存在的鹅膏毒肽检测窗口期较短、检出率较低的缺陷，从而提供一种非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法。
[0007]专利技术人研究发现，现有鹅膏毒肽检测方法对鹅膏毒肽检测窗口期较短、检出率较低的原因在于，现有鹅膏毒肽检测方法仅能针对待测样品中的游离态鹅膏毒肽进行检测，无法针对结合态鹅膏毒肽，而现有的待测样品制备过程仅能分离到生物样品中的游离态鹅膏毒肽，并没有考虑到生物样品中可能存在的其他形态鹅膏毒肽，例如与蛋白结合后的蛋白结合态鹅膏毒肽。
[0008]为此，本专利技术提供一种非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法，所述检测方法包括对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测的操作，其中，所述待测样品由待检样本经蛋白降解处
理后制得。
[0009]其中，对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测的方法例如可以是放射免疫法、酶联免疫法、薄层色谱法、高效液相色谱法或者LC
‑
MS等常用检测方法。
[0010]可选地，所述蛋白降解处理包括蛋白酶水解处理。
[0011]可选地，所述待测样品的制备方法包括：
[0012]取待检样本，与蛋白酶或蛋白酶溶液混合，水解，固相萃取，取洗脱液；
[0013]其中，所述待检样本与蛋白酶或蛋白酶溶液的混合操作使得蛋白酶的终浓度为0.03wt％～0.28wt％。蛋白酶可以溶解在磷酸缓冲溶液或生理盐水中。
[0014]可选地，所述水解的条件包括：水解温度为4～60℃，水解时间为0.5～24h；
[0015]可选的，水解时间为2～12h。
[0016]可选地，所述固相萃取使用的淋洗溶剂为体积百分浓度1～20％的甲醇水溶液，使用的洗脱溶剂为甲醇；
[0017]可选的，所述淋洗溶剂的使用量为水解产物上样量的2～20体积倍，所述洗脱溶剂的使用量为水解产物上样量的2～20体积倍。
[0018]可选地，所述待检样本包括血浆、尿液、胃液、胃肠道内容物匀浆上清液、粪便匀浆上清液及生物组织匀浆上清液中的至少一种；所述生物组织匀浆上清液包括肝脏匀浆上清液和/或肾脏匀浆上清液。
[0019]所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、非限制性水解蛋白酶、限制性水解蛋白酶、内肽酶、外肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天门冬蛋白酶氨酸酶、真菌蛋白酶、细菌蛋白酶、植物蛋白酶、动物蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶中的任一种。
[0020]可选地，采用UPLC
‑
MS/MS法对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测。
[0021]可选地，所述待测样品的制备方法还包括：
[0022]取所述洗脱液，除去溶剂，加入复溶溶剂，复溶后离心，取上清液，其中，所述复溶溶剂为体积百分浓度为5～20％的甲醇水溶液；可选的，复溶过程中还可以加入内标溶液，所述内标溶液为0.5～2μg/mL的微囊藻毒素(或其他结构类似物)甲醇溶液。
[0023]可选地，所述UPLC
‑
MS/MS法的色谱条件包括：
[0024]柱温为30～50℃，流速为0.3mL/min，进样量为5～10μL；以0.2mM乙酸铵
‑
0.1％甲酸水溶液为流动相A、乙腈为流动相B进行梯度洗脱，梯度洗脱程序包括：0～1.5min，流动相中乙腈的体积百分比为20％；1.5～3min，流动相中乙腈的体积百分比为20％
→
30％；3～4min，流动相中乙腈的体积百分比为30％
→
70％；4～4.1min，流动相中乙腈的体积百分比为70％
→
20％；4.1～5.5min，流动相中乙腈的体积百分比为20％。
[0025]可选的，所述UPLC
‑
MS/MS法所用色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(100mm*2.1mm，1.8μm)或其他具有同等分离效果的色谱柱。
[0026]所述UPLC
‑
MS/MS法的质谱条件包括：
[0027]离子源：电喷雾电离源，正离子模式，多反应监测；毛细管电压：3.5kV；离子源温度：150℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂气流速：850L/h；锥孔气流速：50L/h。
[0028]可选地，所述鹅膏毒肽包括：α
‑
鹅膏毒肽、β
‑
鹅膏毒肽、γ
‑
鹅膏毒肽、ε
‑
鹅膏毒肽、鹅膏酸(amanin)、鹅膏蕈(amanullin)和鹅膏酰胺(amaninamide)中的至少一种。
[0029]鹅膏毒肽的化学结构式如下：
[0030][0031]其中，不同鹅膏毒肽对应的取代基如下表所示：
[0032本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非疾病诊断目的的鹅膏毒肽检测方法，其特征在于，所述检测方法包括对待测样品中的鹅膏毒肽进行检测的操作，其中，所述待测样品由待检样本经蛋白降解处理后制得。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白降解处理包括蛋白酶水解处理。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品的制备方法包括：取待检样本，与蛋白酶或蛋白酶溶液混合，水解，固相萃取，取洗脱液；其中，所述待检样本与蛋白酶或蛋白酶溶液的混合操作使得蛋白酶的终浓度为0.03wt％～0.28wt％。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述水解的条件包括：水解温度为4～60℃，水解时间为0.5～24h；可选的，水解时间为2～12h。5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述固相萃取使用的淋洗溶剂为体积百分浓度1～20％的甲醇水溶液，使用的洗脱溶剂为甲醇；可选的，所述淋洗溶剂的使用量为水解产物上样量的2～20体积倍，所述洗脱溶剂的使用量为水解产物上样量的2～20体积倍。6.根据权利要求2～5中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述待检样本包括血浆、尿液、胃液、胃肠道内容物匀浆上清液、粪便匀浆上清液及生物组织匀浆上清液中的至少一种；所述生物组织匀浆上清液包括肝脏匀浆上清液和/或肾脏匀浆上清液；所述蛋白酶选自胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、非限制性水解蛋白酶、限制性水解蛋白酶、内肽酶、外肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天门冬蛋白酶氨酸酶、真菌蛋白酶、细菌蛋白酶、植物蛋白酶、动物蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、羧肽酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶中的任一种。7.根据权利要求3～5任一项所述的检测方法，其特征在于，采用UPLC
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MS/MS法对待测样品中的鹅...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴智君，孙承业，樊晶光，李海蛟，张宏顺，丁春光，代静，郑敏，程娟，赵文锦，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，
类型：发明
国别省市：