合成聚(3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯)的菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种合成聚(3

Strain for synthesizing poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
合成聚(3
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羟基丁酸酯
‑
co
‑4‑
羟基丁酸酯)的菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，特别涉及一种合成聚(3
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羟基丁酸酯
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co
‑4‑ꢀ
羟基丁酸酯)的菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]生物聚酯(也称微生物聚酯，或聚羟基脂肪酸酯，Polyhydroxyalkanoates， PHA)是一类重要的非石油基高分子材料，它是利用可再生的天然原料通过微生物发酵而得到的。目前已发现超过百种PHA高分子，它们具有各自的特性，其中聚3
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羟基丁酸酯(PHB)是PHA早期最典型的代表，也是最廉价的PHA材料。而近几年出现的3
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羟基丁酸酯和4
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羟基丁酸共聚酯 (Poly(3
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hydroxybutyrate
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co
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hydroxybutyrate，简称P34HB)，是一种崭新的最具前景的PHA高分子材料，其4HB含量在0
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100％之间，随着4HB 含量的增加，共聚物由半结晶性的硬脆塑料逐渐改变为强度及韧性均大幅提高的塑料，后转变成非结晶富有弹性的弹性体，使得P34HB高分子的性能可以在很大范围内调节，P34HB具有良好的热稳定性，熔点可在 130
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151℃内改变，分解温度约180℃，加工性较好，可完全生物降解，降解时间随材料中4HB含量和结晶度的高低而变化。P34HB兼具有良好的生物相容性能，生物可分解性和塑料的热加工性能，因此可作为生物医用材料和生物可分解包装材料。由于P34HB是综合性能较为优异的可生物降解高分子材料，国内已有公司开始工业化生产P34HB这种生物聚酯高分子原料，并对其在可降解塑料和生物医学产品方面进行应用开发和推广。
[0003]现有技术中制备3
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羟基丁酸(P3HB)时需要使用化学催化剂进行酯化反应，酯化反应是需要强酸/高温剧烈条件进行，只能在发酵结束后进行酯化，耗能，成本高，周期长，不易于提取精制，制备的3
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羟基丁酸乙酯也容易发生水解，且发酵过程需要灭菌，极大的浪费能源；使用的γ
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丁内酯， 4羟基丁酸等作为P4HB聚酯的前体化合物因价格昂贵，具有毒性，属于易制毒化学品有很大的局限性，P34HB是3HB和4HB的聚合物，因此目前亟需一种成本低、安全无毒、生产效率高的制备P34HB的方法。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种新的P34HB的合成途径，在MDF
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9菌株本身具有合成P3HB途径的基础上，再利用基因工程加入一条以使用谷氨酸(可生物发酵制取)作为前体化合物合成4HB的代谢途径，达成生产P34HB的目的。
[0005]本专利技术提供一种合成聚(3
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羟基丁酸酯
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co
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羟基丁酸酯)的菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0006]S1：体外扩增gadB*、gabT、yqhD三个基因序列；
[0007]S2：将S1所述的gadB*、gabT、yqhD三个基因序列插入载体中，得到载体质粒；
[0008]S3：将S2得到的载体质粒转入Halomonas lutescens MDF
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9感受态细胞中；所述Halomonas lutescens MDF
‑
9的保藏编号为GDMCC NO.61850。
[0009]本申请中使用的Halomonas lutescens MDF
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9菌株已于2021年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称GDMCC地址:广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070)。保藏号为GDMCC NO： 61850。菌株名称为MDF
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9，分类命名为盐单胞菌(Halomonas lutescens)。
[0010]本申请的Halomonas lutescens MDF
‑
9菌株已经在在先申请中公开，申请号为202110929333.2，专利技术名称为“一株盐单胞菌及其应用”。
[0011]进一步的，所述步骤S1中目的基因的扩增体系为：
[0012][0013]进一步的，所述步骤S1中目的基因的扩增程序为：
[0014][0015]进一步的，所述步骤S2中通过重叠延伸PCR得到gadB*基因，将gadB* 与大肠杆菌中的gabT和yqhD通过酶切一起插入pCS27载体的一个操纵子中，得到载体质粒。
[0016]进一步的，所述酶切体系为：
[0017][0018]本专利技术还提供一种合成聚(3
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羟基丁酸酯
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co
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羟基丁酸酯)的工程菌株，由所述的构建方法得到。
[0019]本专利技术还提供一种使用所述的工程菌株生产聚(3
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羟基丁酸酯
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co
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羟基丁酸酯)的方法，包括如下步骤：
[0020](1)平板种子培养：菌种活化；
[0021](2)摇瓶种子培养；
[0022](3)溶氧和pH电极校正；
[0023](4)发酵参数的设定；
[0024](5)接种；
[0025](6)发酵过程控制；
[0026](7)菌体中PHA的提取。
[0027]进一步的，所述步骤(6)中控制发酵罐温度36～38℃。
[0028]进一步的，所述步骤(6)中控制pH为7.5～9.5。
[0029]进一步的，控制pH为8.2～8.5。
[0030]综上，与现有技术相比，本专利技术达到了以下技术效果：
[0031]1.本专利技术中P4HB聚酯可以由生物发酵制得，能够降低生产成本、且安全无毒。
[0032]2.本专利技术使用生物工程材料谷氨酸作为前体化合物，具有环保无污染，价格低，易获得，生产安全系数高的优势。
[0033]3.本专利技术所用的谷氨酸工程菌自身可产生，降低人工劳动量，工艺上更加先进，工厂效率更高。
[0034]4.本专利技术使用嗜盐单胞菌MDF
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9为底盘生物，发酵过程为高盐高碱，因此发酵过程不需要灭菌，操作更加方便，可实现连续接种或补充底物进行不间断发酵，与使用埃希氏菌属、假单胞菌属、气单胞菌属的菌株相比更加节省能源。
附图说明
[0035]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成聚(3
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羟基丁酸酯
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co
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羟基丁酸酯)的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：体外扩增gadB*、gabT、yqhD三个基因序列；S2：将S1所述的gadB*、gabT、yqhD三个基因序列插入载体中，得到载体质粒；S3：将S2得到的载体质粒转入Halomonas lutescens MDF
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9感受态细胞中；所述Halomonas lutescens MDF
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9的保藏编号为GDMCC NO.61850。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中目的基因的扩增体系为：3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中目的基因的扩增程序为：4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中通过重叠延伸PCR得到gadB*基因，将gadB*与大肠杆菌中的gabT和yqhD通过酶切一起插入pCS27载体的一个...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙磊，沈宏伟，吕金艳，叶秀生，田道贺，张恒文，
申请(专利权)人：珠海麦得发生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：