胚胎干细胞保存方法及采用的冻存液和其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种胚胎干细胞冻存液，属于细胞生物学技术领域，本发明专利技术提供一种胚胎干细胞冻存液，包含：血小板裂解物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮，本发明专利技术冻存液能够在不含血清和DMSO的情况下，仅以低浓度的血小板裂解物结合PVA和PVP即能获得与血清+DMSO相当的保存效果，甚至在某些含量下，优于90％血清+10％DMSO组合，但显然本发明专利技术冻存液对细胞毒性更低，且应用更广。应用更广。

Embryonic stem cell preservation method, cryopreservation solution, preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
胚胎干细胞保存方法及采用的冻存液和其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学
，尤其涉及胚胎干细胞保存方法及采用的冻存液和其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是从早期胚胎内细胞团或者胚胎原始生殖细胞分离克隆出来的一种具有无限增殖能力和全向分化能力的干细胞。在特定的条件下，ESCs可以分化为神经细胞、骨细胞、胰岛细胞、心肌细胞等，被称为“万用细胞”。ESCs的主要生物学特性有：(一)在适当的培养条件下可以保持特定的细胞形态和生长特性，具有永久的自我更新能力，并表达特定的细胞表面抗原和酶，具有正常的二倍体核型；(二)具有多分化的潜能性，在适当的诱导条件下可以在体外分化出属于三个胚层的分化细胞；(三)易于基因改造，在体外可以导入异源基因、报告基因或标志基因，并且理论上ESCs经过基因改造后一般仍然能够保持其扩增和分化的全能性。
[0003]由于ESCs细胞经长期培养后可能会出现核型异常、未分化的细胞的克隆数相应的减少等，因此，需要将其进行低温保存。而在低温的环境下，细胞容易受到损伤，需要加入冻存保护液来保护细胞。目前常用的细胞冻存保护液为 10％DMSO+90％胎牛血清(FBS)，其对细胞保护效果好，通用性高，但是配方中含有动物来源的FBS和对细胞有毒性的DMSO，这些因素的存在限制其应用。因此，无毒性，不含血清的冷冻保存液的开发显得尤其必要。
[0004]目前，Park等使用人白蛋白替代FBS，即生理盐水+10％DMSO+9％人体白蛋白作为冷冻保护剂，冻存效果与含血清相比无明显差异
[1]，但是该冷冻保护剂仍然需要加入对细胞存在毒性的DMSO。更进一步地，鲁瑞周等使用5％DMSO+ 羟乙基淀粉(HES)组合冷冻脐带造血干细胞，与10％DMSO相比，两者在细胞存活率方面无显著差异
[2]，该冷冻保护剂虽然不含血清，且降低了DMSO的浓度，减少了对细胞的损伤，但仍然无法做到同时不含血清和DMSO。可见，目前来说，开发不含血清，同时不含DMSO，且不牺牲冻存效果的冷冻保护剂是比较难的。
[0005]血小板裂解物用于细胞冻存已有报道，如CN107027743A，专利技术人采用5％血小板裂解物结合bFGF、L
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谷氨酰胺、海藻糖、羟乙基淀粉、羧甲基纤维素钠和甘油来冻存脂肪干细胞，其中血小板裂解物可以降低溶液中电解质的浓度，减少阳离子进入细胞的数量。采用该冻存液冻存脂肪干细胞12个月后，细胞存活率能够达到93％，且不影响脂肪干细胞分化能力。在CN108617638B中，专利技术人采用5～20％的血小板裂解物结合DMSO、HSA、PVP、D
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海藻糖和血清来冻存皮肤组织或细胞，相比不含血小板裂解物的冻存保护液，该保护液能够更好地保护冻存的细胞或组织，冻存的细胞活力和活率明显提高。可见，将血小板裂解物添加到冻存液中，可能仍然需要加入DMSO和/或血清才能获得良好的冻存效应。
[0006][1]Park S,Lee DR,Nam JS,et al.Fetal bovine serum
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free cryopreservation methods for clinical banking of human adipose
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derived stem cells[J].Cryobiolog y,2018,81:65
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73.
[0007][2]鲁瑞周，贺雪萍，王丹丹等.DMSO联合HES冷冻保护剂对脐带造血干细胞冷冻影响研究[J].现代诊断与治疗，2012，23(12):2098
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2099.

技术实现思路

[0008]本专利技术目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种不依赖血清和 DMSO的胚胎干细胞冻存液，采用本专利技术冻存液冻存后细胞复苏存活率与血清和DMSO冻存相比无明显差异，但前者对细胞损伤更小。
[0009]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为:
[0010]本专利技术提供一种胚胎干细胞冻存液，包含：血小板裂解物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。
[0011]聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮都属于非渗透性冷冻保护剂，聚乙烯醇具有在降温过程中抑制冰晶形成的作用；聚乙烯吡咯烷酮能够对细胞膜提供一定的保护作用。目前未见将血小板裂解物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮作为冷冻保护剂，而不依赖血清和DMSO。
[0012]试验证明，加入血小板裂解物后，相比不含血小板裂解物配方的冻存液，细胞存活率更高，且更多的细胞维持在不分化状态。
[0013]另外，本专利技术还提供一种胚胎干细胞冻存液，在所述冻存液中，血小板裂解物的体积分数小于1.5％，但是大于0.2％。
[0014]另外，本专利技术还提供一种胚胎干细胞冻存液，在所述冻存液中，血小板裂解物的体积分数小于1％，但是大于0.2％。
[0015]另外，本专利技术还提供一种胚胎干细胞冻存液，在所述冻存液中，以体积分数计，血小板裂解物的含量为0.3～1.5％，聚乙烯醇的含量为1～3％，聚乙烯吡咯烷酮的含量为1～5％。
[0016]另外，本专利技术还提供一种胚胎干细胞冻存液，在所述冻存液中，以体积分数计，血小板裂解物的含量为0.3～1％，聚乙烯醇的含量为1～3％，聚乙烯吡咯烷酮的含量为1～5％。
[0017]另外，本专利技术还提供一种胚胎干细胞冻存液，在所述冻存液中，以体积分数计，血小板裂解物的含量为0.3～0.8％，聚乙烯醇的含量为1～3％，聚乙烯吡咯烷酮的含量为1～5％。
[0018]本专利技术对血小板裂解物的含量作了进一步限定，是因为专利技术人意外发现，在低含量血小板裂解物下(＜1.5％)，与聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮组合表现出更理想的冻存效应，当血小板裂解物的含量维持在0.3～1.5％之间时，这种剂量与效果存在规律性，但是含量并不是越低越好，当＜0.3％时，效果却发生了明显地下降。这一现象与现有研究相反，因为在之前的研究中，技术人员常常采用的是5％以上含量的血小板裂解物，例如
技术介绍
中的两篇现有文献分别采用了5％和5～15％的值，均显示出良好的冻存效果，且通常认为由于血小板裂解物含有较多利于细胞生长的因子，因此，理论上认为含量高的血小板裂解物更利于细胞的保存，而本专利技术却与之相反。这可能是与冻存液中存在的其他两种成分聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮有关，低浓度的血小板裂解液与聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮之间存在某种作用，这种作用表现出利于细胞的保护。
[0019]在一些具体实施方案中，通常来讲聚乙烯醇的含量可以为1～3％之间的任意值，
聚乙烯吡咯烷酮的含量可以为1～5％之间的任意值，此时，血小板裂解物的含量最好为0.3％～1.5％之间的任意值，更好地是含量为0.3～1％之间的任意值，更好地是含量为0.3～0.8％之间的任意值，优选含量为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、 0.7％和0.8％。这些含量中，血小板裂解物含量为0.4％、0.5％和0.7本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.胚胎干细胞冻存液，其特征在于，包含：血小板裂解物、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。2.如权利要求1所述冻存液，其特征在于，在所述冻存液中，血小板裂解物的体积分数小于1.5％，但是大于0.2％。3.如权利要求2所述冻存液，其特征在于，在所述冻存液中，血小板裂解物的体积分数小于1％，但是大于0.2％。4.如权利要求1所述冻存液，其特征在于，还包括缓冲液。5.如权利要求4所述冻存液，其特征在于，所述缓冲液为PBS或Hepes缓冲液。6.如权利要求1～5任一项所述冻存液，其特征在于，在所述冻存液中，血清和DMSO的含量为0。7.如权利要求3所述冻存液，其特征在于，在所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉玲，方贺，
申请(专利权)人：李玉玲，
类型：发明
国别省市：