人多能干细胞冻存液及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种人多能干细胞冻存液，包括基础细胞培养基、冷冻保护剂和信号通路抑制剂组合物，所述信号通路抑制剂组合物包括CHIR

Cryopreservation solution of human pluripotent stem cells and its application

【技术实现步骤摘要】
人多能干细胞冻存液及其应用


[0001]本专利技术涉及细胞冻存复苏
更具体地，涉及人多能干细胞冻存液及其应用。

技术介绍

[0002]人多能干细胞（human pluripotent stem cell, hPSC）包括胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）、核移植胚胎干细胞（nuclear transfer embryonic stem cell，ntESC）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）等，具有“自我更新”和“三向分化”两大潜能，即人多能干细胞保持“干性”的同时可在体外无限增殖，并具有向三胚层所有类型细胞分化的潜能。通过人多能干细胞定向分化获得的衍生功能细胞可补充或替代病损细胞、组织和器官，是再生医学的核心。开发满足临床应用和工业生产关键质量属性的人多能干细胞冻存方法和试剂迫在眉睫。
[0003]首先，人多能干细胞冻存液属于细胞治疗产品的原材料。《中国药典》2020版明确指出，细胞治疗产品原材料的选择原则应基于风险控制原则，即在原料级别的选择上，药用级别优于非药用级别、化学源性优于生物源性、非动物源性优于动物源性。目前常用实验室配制、专利CN113025654A和专利CN108552156A公开的人多能干细胞冻存液都含有一定浓度的胎牛血清或血清替代物，属于含动物源性成分、成分不明确的冻存液。专利CN112544613A公开的人多能干细胞冻存液含多种细胞因子，包括转铁蛋白、碱性生长因子和转化生长因子，属于富含生物源性成分的冻存液。这些人多能干细胞冻存液在细胞治疗产品的原材料风险控制和级别方面存在较大提升空间，研发无动物源性成分、成分明确、无蛋白的人多能干细胞冻存液将大幅提高其作为细胞治疗产品原材料的合规性。
[0004]其次，人多能干细胞冻存液应满足工业生产的关键质量指标，包括成本低廉、稳定性高和简便快速。在成本控制方面，基于血清、血清替代物和多种蛋白成分的人多能干细胞冻存液成本高昂；使用化合物组合替代全部蛋白成分可将成本降低85%以上。在稳定性方面，人多能干细胞冻存液含有的血清、血清替代物和多种蛋白成分存在保存效期短、保存条件严苛、生物活性批次间稳定性差等缺点，导致不同批次冻存的人多能干细胞冻存复苏后细胞活率常常超出控制上下限。在简便快速方面，专利CN107494521A公开的冻存液和Thermo Fisher公司的CTS
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PSC 冻存试剂盒均需按浓度梯度逐级渗透、程序性降温至
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80℃，操作繁琐、耗时长。研发成本低廉、稳定性高和简便快速的人多能干细胞冻存液是实现普惠型人多能干细胞保存及细胞治疗产品的工业基础。
[0005]参考《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》（试行）等合规性文件，使用人多能干细胞冻存液冻存的人多能干细胞是临床诊疗和细胞治疗产品的原材料，应能在液氮冻存条件下一定时间内保留人多能干细胞的生物学特性、安全性、稳定性、有效性等关键质量属性。市场广泛应用的Thermo Fisher公司的CTS
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PSC 冻存试剂盒和专利CN108552156A公开的冻存液均未全面考察冻存复苏后人多能干细胞的关键质量属性。Thermo Fisher公司官网未公开且不提供CTS
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PSC 冻存试剂盒的关键质量属性研究数据，专利CN108552156A
仅考察了冻存复苏后人多能干细胞的部分生物学特性和部分稳定性指标，仅包括细胞形态、细胞标志物表达水平和存活率。缺乏合规的质量研究严重制约了人多能干细胞冻存液的产业转化和临床应用。
[0006]因此，亟待研发原料级别高、成分明确、不含蛋白质成分、成本可控、简便快速、验证充分的人多能干细胞冻存液，满足日益迫切的临床应用和工业生产需求。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一个目的在于提供一种人多能干细胞冻存液，该人多能干细胞冻存液不含蛋白质成分、不需要程序降温、验证充分，解决现有人多能干细胞冻存液的技术缺陷、满足临床应用和工业生产关键质量属性的要求。
[0008]为达到第一个目的，本专利技术提供了一种人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述人多能干细胞冻存液包括以下组分：基础细胞培养基、冷冻保护剂和信号通路抑制剂组合物；所述信号通路抑制剂组合物包括CHIR
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99021，ID
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8和Y
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27632，进一步地，所述CHIR
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99021占整体冻存液的体积摩尔浓度为50
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500 nM，ID
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8占整体冻存液的体积摩尔浓度为100
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1000 nM，Y
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27632占整体冻存液的体积摩尔浓度为1
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30 μM；且人多能干细胞冻存液不含有任何蛋白质成分。
[0009]动物血清、转铁蛋白、人血清白蛋白等均属于蛋白质成分，冻存液中不含有上述蛋白质成分，原料级别高，风险控制好。
[0010]冻存液中不含有蛋白质成分，复苏后细胞活率较低；如果加入合适的信号通路抑制剂可以提高细胞活率，但活率仍偏低。但本申请专利技术人经过研究发现，如选择加入CHIR
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99021，ID
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8和Y
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27632，分别属于GSK3β信号通路抑制剂、DYRK信号通路抑制剂和ROCK信号通路抑制剂，能够产生协同作用，在不含有蛋白质成分的情况下，大幅提高复苏后的细胞活率。在性能测试过程中专利技术人还发现，冻存液中同时加入CHIR
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99021，ID
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8和Y
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27632，人多能干细胞冻存时，非程序性降温相对于程序性降温，复苏后细胞活率接近，从而使冻存过程更加简便快速。
[0011]进一步地，所述CHIR
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99021占整体冻存液的体积摩尔浓度为100
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250 nM；ID
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8占整体冻存液的体积摩尔浓度为250
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750 nM；Y
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27632占整体冻存液的体积摩尔浓度为8
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12 μM。单位“nM”在本领域是明确的，代表nmol/L；单位“μM”在本领域是明确的，代表μmol/L。
[0012]本领域中，基础细胞培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。进一步，所述基础细胞培养基为：DMEM、RPMI1640和DMEM/F
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12中的一种或几种。
[0013]优选地，所述基础细胞培养基为DMEM/F
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12，占整体冻存液的体积百分比为78.5
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98.5% v/v；更优选的，所述DMEM/F
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12培养基占整体冻存液的体积百分比为82
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92.5% v/v。
[0014]进一步，所述冷冻保护剂为二甲基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述人多能干细胞冻存液包括以下组分：基础细胞培养基、冷冻保护剂和信号通路抑制剂组合物；所述信号通路抑制剂组合物包括CHIR
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99021、ID
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8和Y
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27632，所述CHIR
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99021占整体冻存液的体积摩尔浓度为50
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500 nM，所述ID
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8占整体冻存液的体积摩尔浓度为100
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1000 nM，所述Y
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27632占整体冻存液的体积摩尔浓度为1
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30 μM；且所述人多能干细胞冻存液不含有任何蛋白质成分。2.根据权利要求1所述的人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述CHIR
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99021占整体冻存液的体积摩尔浓度为100
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250 nM，ID
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8占整体冻存液的体积摩尔浓度为250
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750 nM，Y
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27632占整体冻存液的体积摩尔浓度为8
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12 μM。3.根据权利要求1所述的人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述基础细胞培养基为：DMEM、RPMI1640和DMEM/F
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12中的一种或几种，占整体冻存液的体积百分比为78.5
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98.5% v/v。4.根据权利要求1所述的人多能干细胞冻存液，其特征在于，所述基础细胞培养基为DMEM/F
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【专利技术属性】
技术研发人员：佟曼，向葱，叶真龙，向可欣，钱其军，
申请(专利权)人：上海细胞治疗集团有限公司，
类型：发明
国别省市：