成像流式细胞仪、分选方法以及校准方法技术

本发明专利技术提供一种能够以简单的结构考虑了对象物的速度偏差的分选精度高的成像流式细胞仪。成像流式细胞仪(1)，具有：对第一、第二点(25a、25b)照射第一、第二激光的激光单元(20)；对第一、第二点(25a、25b)进行拍摄的第一、第二摄像部(52a、52b)；对通过第一、第二点(25a、25b)的粒子(P)进行检测的第一、第二检测器(32a、32b)；对第一、第二摄像部(52a、52b)发出摄像时机指示信号(SG1)的第一粒子检测部(70)；接收第一、第二摄像部(52a、52b)拍摄的图像(D1)的图像存储部(82)；和判断粒子(P)是否为对象粒子的分选判断部(84)，第一、第二摄像部(52a、52b)基于摄像时机指示信号(SG1)切取所拍摄的粒子(P)的图像(D1)。所拍摄的粒子(P)的图像(D1)。所拍摄的粒子(P)的图像(D1)。

Imaging flow cytometer, sorting method and calibration method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】成像流式细胞仪、分选方法以及校准方法


[0001]本专利技术涉及一种使用图像对细胞等对象物进行分选的成像流式细胞仪、分选方法以及校准方法。

技术介绍

[0002]一般而言，对细胞等对象物进行分选的流式细胞仪具有：检测来自对象物的信号的检测部；基于由检测部得到的信号，判断是否为特定的对象物的分选判断部；和基于分选判断部的判断结果，对对象物进行分选的分选部(例如，专利文献1)。为了提高对象物的分选精度，需要使分选部与特定的对象物到达分选部的时机一致地进行动作。
[0003]在现有的流式细胞仪中，分选判断部进行信号处理所需要的时间较短，大致在1毫秒以内。现实上，在流路中流动的对象物具有基于对象物的速度偏差。例如，大小不同的细胞有时速度不同。另外，即使是相同大小的细胞，在流路内的中心附近流动的细胞的速度也变快。
[0004]与此相对，通过缩短从检测部到分选部的距离，能够抑制对象物的速度偏差的影响。因此，在现有的流式细胞仪中，一般不考虑对象物的速度偏差，在对象物通过检测部之后，在经过一定的延迟时间的时机使分选部动作。
[0005]另一方面，在使用图像判断是否是特定的对象物的成像流式细胞仪中，有时用于取得必要的信息的信号处理时间变长，例如，有时需要2～32毫秒左右的时间。在这种情况下，需要延长从检测部到分选部的距离。当不考虑对象物的速度偏差，在对象物通过检测部后，在经过一定的延迟时间的时机使分选部动作时，由于速度偏差的影响，分选精度降低。
[0006]为了抑制由于这样的速度偏差引起的分选精度的降低，提出了具有测量各个对象物的速度测量部的结构。例如，在专利文献1中，公开了使用光栅(衍射光栅)的速度测量部。另外，在非专利文献1中，公开了如下结构：在对象物流动的流路的上游侧和下游侧配置激光点(laser spot)，根据对象物通过各激光点的时机，测量各个对象物的速度。
[0007]另外，在专利文献2中，公开了如下方法：对对象物进行时滞拍摄并根据每帧的对象物的位置变化计算其速度，并预测各个对象物到达分选部的时机。
[0008]现有技术文献
[0009]专利文献
[0010]专利文献1：美国专利第6，532，061号公报
[0011]专利文献2：国际公开第2011/105507号
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献1：N.Nitta et al.，Intelligent Image
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Activated Cell Sorting.Cell175，266
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276(2018)
[0014]在如专利文献1那样使用光栅的速度测量部中，在多个对象物以接近的状态在流路中流动的情况下，难以测量各个对象物的速度。
[0015]另外，即使能够测量各个对象物的速度，在专利文献1中也分别独立地进行速度信
号和细胞分选的计算，将这些结果输入到延迟处理电路来控制分选部。因此，无法确保将由照相机拍摄的各个图像和由速度测量部测量的各个对象物的速度准确地并一一对应地进行关联。当来自不同的对象物的图像的处理结果和速度信息被错误地关联时，由于无法正确地进行分选而成为问题。具体而言，在以较高的吞吐量使对象物在流路中流动的情况下，各个对象物的信号间隔变窄，根据情况，信号重复地埋没，有时在关联上引起错误。或者，在测量对象物较小的情况下等，虽然在照相机中被识别但在速度检测部中无法被检测到的情况下，也可能会在信号的一一对应中发生错误。
[0016]如非专利文献1那样，根据使用两个激光点的结构，即使对于接近的多个对象物，也能够测量各个对象物的速度。但是，在使用两个激光点的结构中，为了进行速度检测，除了用于细胞的摄像的激光照射之外，还需要另外准备用于速度检测的对两处的激光照射，装置规模大。进而，由于速度检测和细胞摄像的信号发出的时机依赖于各个激光点的位置，因此只要激光点的位置不完全一致，就会在时机产生错开。需要用于对应于该错开的校准，操作变得复杂。
[0017]另外，为了进行在流式细胞仪中流动的粒子的摄像或检测，通常使用物镜，但是从物镜得到的视野(field of view)是有限的。在非专利文献1的方法中，至少需要将速度测量用的2点和图像摄像用的1点收纳在物镜的视野内，但为了防止光的泄漏等，需要在点之间隔开一定程度的间隔。因此，特别是在图像摄像用中想要设定多个点的情况下等，在物镜的视野中的激光点的场所的取得成为课题。例如，在想要分别对照射不同波长的激发光时所得到的荧光图像进行拍摄的情况下，考虑对于不同波长的每个激发光位置分离地设置激光点。但是，在这种情况下，进一步在速度检测用中设定2点成为设计上的负担。
[0018]在专利文献2中，公开了摄像机对在流路中流动的细胞进行时滞拍摄，通过从该一连串的图像进行细胞的跟踪来进行可靠的细胞分离的方法。然而，在专利文献2所记载的方法中，为了从一连串的时滞图像追踪细胞，需要较大的计算负荷。进而，为了进行细胞的追踪，需要在包含细胞分类部的广视野下进行拍摄，因此，为了以高空间分辨率拍摄细胞图像，画面整体的像素数变得非常大，信息处理的负荷变高，另一方面，由于减少像素数会牺牲空间分辨率，因此存在不能得到细胞的详细的形态信息等的界限。

技术实现思路

[0019]本专利技术的目的在于，提供一种能够以简单的结构考虑了对象物的速度偏差的分选精度高的成像流式细胞仪、分选方法以及校准方法。
[0020]本专利技术的第一观点是一种成像流式细胞仪，其具有：
[0021]激光单元，所述激光单元向粒子流动的流路上的第一点以及第二点分别照射第一激光以及第二激光；
[0022]第一摄像部，所述第一摄像部对所述第一点进行拍摄；
[0023]第二摄像部，所述第二摄像部对所述第二点进行拍摄；
[0024]第一检测器，所述第一检测器检测通过所述第一点的所述粒子；
[0025]第二检测器，所述第二检测器检测通过所述第二点的所述粒子；
[0026]第一粒子检测部，所述第一粒子检测部基于所述第一检测器以及所述第二检测器所取得的信号，检测所述粒子，并且对所述第一摄像部以及所述第二摄像部发出指示摄像
时机的摄像时机指示信号；
[0027]系统时间管理部，所述系统时间管理部对所述第一粒子检测部发出系统时间；
[0028]图像存储部，所述图像存储部接收所述第一摄像部以及所述第二摄像部所拍摄的图像；以及
[0029]分选判断部，所述分选判断部判断所述粒子是否为对象粒子，
[0030]所述第一摄像部以及所述第二摄像部基于所述摄像时机指示信号，切取(提取、剪切)出所拍摄的所述粒子的图像。
[0031]本专利技术的第二观点是一种分选方法，包括：
[0032]激光单元分别对粒子流动的流路上的第一点以及第二点照射第一激光以及第二激光，
[0033]第一检测器检测通过所述第一点的所述粒子，
[0034]第二检测器检测通过所述第二点的所述粒子，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种成像流式细胞仪，其特征在于，具有：激光单元，所述激光单元向粒子流动的流路上的第一点以及第二点分别照射第一激光以及第二激光；第一摄像部，所述第一摄像部对所述第一点进行拍摄；第二摄像部，所述第二摄像部对所述第二点进行拍摄；第一检测器，所述第一检测器检测通过所述第一点的所述粒子；第二检测器，所述第二检测器检测通过所述第二点的所述粒子；第一粒子检测部，所述第一粒子检测部基于所述第一检测器以及所述第二检测器所取得的信号，检测所述粒子，并且对所述第一摄像部以及所述第二摄像部发出指示摄像时机的摄像时机指示信号；系统时间管理部，所述系统时间管理部对所述第一粒子检测部发出系统时间；图像存储部，所述图像存储部接收所述第一摄像部以及所述第二摄像部所拍摄的图像；以及分选判断部，所述分选判断部判断所述粒子是否为对象粒子，所述第一摄像部以及所述第二摄像部基于所述摄像时机指示信号，切取出所拍摄的所述粒子的图像。2.根据权利要求1所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述激光单元照射具有互不相同的波长的所述第一激光和所述第二激光。3.根据权利要求1或2所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述第一摄像部以及所述第二摄像部分别具有线传感器。4.根据权利要求1至3中任一项所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述第一摄像部以及所述第二摄像部沿着所述流路的轴向配置。5.根据权利要求1至4中任一项所述的成像流式细胞仪，其特征在于，第一粒子检测部对所述第一摄像部以及所述第二摄像部发送以所述粒子单位赋予的识别编号。6.根据权利要求1至5中任一项所述的成像流式细胞仪，其特征在于，所述第一摄像部以及所述第二摄像部分别将切取出的所述粒子的图像和所述粒子的所述识别编号发送到所述图像存储部。7.根据权利要求1至6中任一项所述的成像流式细胞仪，其特征在于，还具有：延迟时间计算部，所述延迟时间计算部计算所述粒子的延迟时间；分选信号控制部，所述分选信号控制部根据所述分选判断部的判断结果，为了与由所述延迟时间计算部所计算的时机一致地对所述粒子进行分选而发出分选信号；以及分选部，所述分选部基于所述分选信号，对所述对象粒子进行分选，所述延迟时间计算部基于所述第一检测器以及所述第二检测器取得信号的时机的所述系统时间，计算直到所述粒子到达所述分选部的所述延迟时间。8.根据权利要求7所述的成像流式细胞仪，其特征在于，还具有第二粒子检测部，所述第二粒子检测部检测通过检测位置的所述粒子，所述检测位置位于所述流路上比所述第一点以及所述第二点靠下游的位置，所述延迟时间计算部将基于所述粒子通过所述第一点以及所述第二点的系统时间计
算的所述粒子到...

【专利技术属性】
技术研发人员：新田尚，杉村武昭，
申请(专利权)人：株式会社CYBO，
类型：发明
国别省市：