本发明专利技术公开了一种人脂肪组织脱细胞外基质及其制备与应用，涉及生物医用材料技术领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：S1、制备浓缩的纳米脂肪；S2、彻底破碎脂肪细胞；S3、去除化学试剂。其原则和传统方法相比，主要是减少化学和生物试剂的接触时间，增加物理处理时间。该方法和传统方法相比，在制备时间上大大减少，操作简化，尤其是异丙醇和胰酶的处理被完全省略。所得细胞外基质中保留的蛋白中类更多，促成脂的蛋白种类也更多，移植后的中远期血管化及成脂能力也都高于传统方法，在今后的实验研究和临床治疗中具有广阔的应用前景。究和临床治疗中具有广阔的应用前景。究和临床治疗中具有广阔的应用前景。
A human adipose tissue acellular extracellular matrix and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种人脂肪组织脱细胞外基质及其制备与应用
[0001]本专利技术涉及生物医用材料
，具体涉及一种人脂肪组织脱细胞外基质及其制备与应用。
技术介绍
[0002]脂肪组织脱细胞外基质(decellularized adipose tissue，DAT)具有来源相对丰富，无免疫排斥，与人工合成的基质材料相比具有天然的外基质结构等优势，既可作为组织缺损修复的理想材料，又可作为干细胞，细胞因子等的基质材料，增强修复的效能，有广泛的应用前景，成为目前基质材料开发的重要方向。然而如何提高脱细胞基质材料的修复效果，又能最大限度减少可能的不安全因素是脱细胞脂肪组织制备需要解决的关键科学问题。
[0003]DAT的提取方法多种多样，但都缺乏统一共识。纯物理匀浆法无法有效去除DNA、RNA，仅限于实验研究。过少的化学生物干预则会影响脱细胞和去油、去水的效果，无法得到高效的外基质支架。过多的化学试剂和生物酶作用又有可能损坏生物支架的完整性，增加临床使用的不安全因素。国内外很多团队试图减少制备时间，提高制备效率，并且制备出符合临床使用标准的脱细胞脂肪组织外基质。
[0004]Flynn团队曾通过物理+化学+生物酶制剂联合脱细胞方式得到DAT。该方法所得DAT基本保留了细胞外基质结构及有关生物活性物质，如层粘连蛋白和Ⅳ型胶原，且能诱导ADSCs成脂分化。这是一种传统的5日脱细胞法，其主要方案大体可以概括为反复缓冲溶液冻融，反复的酶溶液消化。其具体方案如下：通过吸脂手术所获取的剩余脂肪组织样品首先在等体积的缓冲液中进行三次冻融循环(
‑
80℃至37℃)，每次冻融30min。该缓冲液是含有10mmol/L Tris碱和5mmol/L乙二胺四乙酸的低渗Tris缓冲液(pH8.0)。接下来，将组织转移至3/2体积胰蛋白酶中消化，其由0.25％胰蛋白酶/0.1％EDTA(Gibco公司，美国)组成，并将组织震荡12小时。随后，将消化后的脂肪组织样品至于在3/2体积的99.9％异丙醇中进行40小时极性溶剂萃取以除去脂质。然后将处理过的组织放在含有8g/L NaCl，200mg/L KCl，1g/L Na2HPO4和200mg/L KH2PO4(pH 8.0)的漂洗缓冲液中漂洗三次(每次30min)，洗涤后的脂肪组织样本颜色明显变浅，然后再将样本放入胰蛋白酶中震荡消化并6小时。在酶消化步骤结束后。将组织放在上文所述的极性缓冲溶液中再洗涤三次后(每次30min)，将样品转移到含有55mmol/L Na2HPO4，17mmol/L KH2PO4，4.9mmol/L MgSO4·
7H2O，15000U DNase II型，来自牛胰腺(sigma公司，美国)的酶消化溶液中，12.5mg RNase III A型，来自牛胰腺(sigma公司，美国)和2000单位脂肪酶VI
‑
S型，来自猪胰腺(sigma公司，美国)处理过夜14小时。第二天早上，再将样本置入磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)中漂洗三次，每次30min，并在99.9％浓度的异丙醇中进行最终极性溶剂萃取8小时。在处理结束时，将DAT在PBS缓冲液中再漂洗三次，每次30min，然后在去离子水中漂洗三次，每次30min。将组织在
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40℃真空冷冻干燥机(北京亚星仪科科技发展有限公，中国)冻干36小时，然后将组织通过60Coγ(广州市辐照工程技术研究中心，中国)辐照48小时。此时脂肪组织的脱细胞
程序完成，可以放入
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80℃冰箱(Sanyo公司，日本)储存备用。该方法制备时间比较久，脂肪组织在制备过程中要经历异丙醇、生物酶等消化，这对于DAT的生物相容性和安全性提出了挑战。此外，由于脂肪组织经过了漫长而繁琐的制备步骤，长期浸润于各种化学试剂内，最终所制备出的DAT的蛋白含量和结构完整度也受到影响，成脂效率低下，临床应用受限。
技术实现思路
[0005]为了克服现有技术的缺点和不足，本专利技术的首要目的在于提供一种人脂肪组织脱细胞外基质的制备方法。本专利技术对脱细胞方法进行改进，其原则是减少化学和生物试剂的接触时间，尽可能采用物理处理的方法，目的是在保证脂肪组织脱细胞彻底的基础上，使得外基质结构，完整性以及包含的细胞外基质(ECM)成分可以更好的保存。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的人脂肪组织脱细胞外基质。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供上述人脂肪组织脱细胞外基质的应用。
[0008]为实现以上目的，本专利技术采用了以下技术方案：
[0009]一种临床即用型人脂肪组织脱细胞外基质的制备方法，包括如下步骤：
[0010]S1、制备浓缩的纳米脂肪：
[0011]①
初步离心去水：将获取的人源性的颗粒脂肪进行初步离心处理，去除液体层；
[0012]②
切割脂肪细胞：将步骤
①
获取的颗粒脂肪用双螺母连接器进行切割处理，过滤；
[0013]③
负压离心去油：将步骤
②
获取的纳米脂肪分置于两个用连接器连接的螺旋注射器，同时回拉两个注射器制造负压，来回推拉后混匀；
[0014]④
第二次离心进一步去油：将步骤
③
获取的纳米脂肪进行第二次离心处理，收集中层纳米脂肪，即获得浓缩后的纳米脂肪(CNF)；
[0015]S2、彻底破碎脂肪细胞：
[0016]将步骤S1获取的纳米脂肪放入液氮进行急速冷冻处理，后37℃复温，再进行离心处理，去上清；将获取的组织加入等体积的去离子水进行匀浆处理，匀浆后离心处理，去上清，收集下层白色组织；
[0017]S3、去除化学试剂：将步骤S2获取的组织进行反复漂洗，冷冻干燥处理，即获得人脂肪组织脱细胞外基质。
[0018]进一步地，所述步骤S1中，颗粒脂肪是脂肪抽吸手术中获取的脂肪组织。
[0019]进一步地，所述步骤S1中，初步离心处理的条件为800～1200g，2～4min；优选为1000g，3min；第二次离心处理的条件为1800～2200g，2～4min；优选为2000g，3min。
[0020]进一步地，所述步骤S1中，切割处理的具体操作为：将步骤
①
获取的颗粒脂肪依次用间距为2.4mm和1.2mm和1.0mm的双螺母连接器各切割处理25～35次；优选30次。
[0021]进一步地，所述步骤S1中，过滤采用的筛网目数为400～600目；优选为500目。
[0022]进一步地，所述步骤S1中，所述螺旋注射器的型号为10ml。
[0023]进一步地，所述步骤S1中，所述负压范围是0～18kPa。
[0024]进一步地，所述步骤S1中，来回推拉的次数为4～6次；优选5次。
[0025]进一步地，所述步骤S2中，急速冷冻处理的时间为25～35min；优选30min。
[0026]进一步本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种临床即用型人脂肪组织脱细胞外基质的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、制备浓缩的纳米脂肪：
①
初步离心去水：将获取的人源性的颗粒脂肪进行初步离心处理，去除液体层；
②
切割脂肪细胞：将步骤
①
获取的颗粒脂肪用双螺母连接器进行切割处理，过滤；
③
负压离心去油：将步骤
②
获取的纳米脂肪分置于两个用连接器连接的螺旋注射器，同时回拉两个注射器制造负压，来回推拉后混匀；
④
第二次离心进一步去油：将步骤
③
获取的纳米脂肪进行第二次离心处理，收集中层纳米脂肪，即获得浓缩后的纳米脂肪；S2、彻底破碎脂肪细胞：将步骤S1获取的纳米脂肪放入液氮进行急速冷冻处理，后37℃复温，再进行离心处理，去上清；将获取的组织加入等体积的去离子水进行匀浆处理，匀浆后离心处理，去上清，收集下层白色组织；S3、去除化学试剂：将步骤S2获取的组织进行反复漂洗，冷冻干燥处理，即获得人脂肪组织脱细胞外基质。2.根据权利要求1所述的临床即用型人脂肪组织脱细胞外基质的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，初步离心处理的条件为800～1200g，2～4min；第二次离心处理的条件为1800～2200g，2～4min；所述步骤S1中，切割处理的具体操作为：将步骤
①
获取的颗粒脂肪依次用间距为2.4mm和1.2mm和1.0mm的双螺母连接器各切割处理25～35次；所述步骤S1中，过滤采用的筛网目数为400～600目。3.根据权利要求1或2所述的临床即用型人脂肪组织脱细胞外基质的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，急速冷冻处理的时间为25～35min；所述步骤S2中，离心处理的条件均为2500～3500g，4～6min；所述步骤S2中，匀浆处理的条件为8000～12000g，12～17min。4.根据权利要求3所述的临床即用型人脂肪组织脱细胞外基质的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，漂洗的具体操作为：将步骤S2获取的组织先在PBS缓冲液漂洗三次，每次30min，然后再在去离子水中漂洗三次，每次30min；所述步骤S3中，冷冻干燥处理的条件为
‑
40℃，34～38h。5.根据权利要求1所述的临床即...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋笑，刘宏伟，唐灵芝，黄红茵，赖芯蕊，李泽华，吴引弟，李升红，廖选，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：
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